Temerosidad en ratas heterogéneas (N/NIH-HS) y romanas (RHA/RLA): estudios hormonales y de expresión génica diferencial

Abstract

La presente Tesis tuvo como objetivos, estudiar la diferencia en ansiedad y otros rasgos conductuales relacionados (p. ej. miedo, susceptibilidad al estrés), a través de una batería de tests conductuales, en tres cepas o stocks de ratas diferentes (RHA-I -poco ansiosas-, RLA-I –muy ansiosas- y N/Nih-HS –ratas genéticamente heterogéneas-), y relacionar dichos perfiles conductuales/psicológicos con la expresión diferencial de genes en estructuras/circuitos cerebrales de conocida importancia en tales fenotipos (p. ej. amígdala e hipocampo). Para alcanzar tales objetivos, se realizaron dos estudios (Estudio 1, con 128 ratas macho de los tres stocks/cepas mencionados; Estudio 2, con 114 ratas macho), que incluyeron las siguientes pruebas conductuales: Laberinto Circular Elevado (ansiedad incondicionada), test de actividad en situación de novedad (“timidez” y habituación en una “Caja nueva”), test de Campo Abierto, miedo condicionado a un contexto (respuesta de petrificación condicionada), adquisición de evitación activa en dos sentidos en la “Shuttle-box” (ansiedad debida a un conflicto de doble evitación –pasiva y activa- condicionada) y test de natación forzada (como modelo de síntomas relacionados con la depresión y los efectos de los antidepresivos). En el Estudio 1 se obtuvieron también medidas hormonales (ACTH, corticosterona y prolactina) en respuesta al estrés de exponer los animales a una ambiente nuevo y desconocido durante 20 minutos. Tras el análisis conductual y hormonal de estos dos estudios, en el Estudio 3 se llevó a cabo un análisis de expresión génica en amígdala e hipocampo (análisis de microarray y qRT-PCR) de subgrupos de ratas N/Nih-HS seleccionadas (a partir del Estudio 1) por presentar valores extremos en ansiedad (subgrupos de “Baja ansiedad” o “Alta ansiedad”). A partir de este análisis se pudo concluir que: a) las ratas N/Nih-HS presentan un perfil de comportamiento defensivo y hormonal cercano al estilo de afrontamiento pasivo característico de las ratas RLA-I; b) la heterogeneidad genética de las ratas N/Nih-HS y los resultados obtenidos en el análisis de microarray, permiten que sea un modelo animal útil para el estudio de las bases genéticas de la ansiedad y el miedo; c) los análisis de microarray han detectado expresión diferencial (entre dichos subgrupos de ratas extremas en ansiedad) de genes implicados en la regulación de funciones neuroendocrinas, como la prolactina, arginina-vasopresina y la oxitocina, que podrían modular las respuestas de ansiedad y miedo condicionado en amígdala e hipocampo. d) También se ha observado expresión diferencial (entre ambos subgrupos de ratas extremas en ansiedad) de genes reguladores de receptores sensoriales (sobretodo olfativos), genes de receptores opioides (como Oprd1 y Oprl1), genes que participan en funciones inmunológicas (como el gen H2-M9) y genes relacionados con la función tiroidea, como el gen TRH, Tg en hipocampo o el gen Duox2 en amígdala.

The main aim of the present Thesis was to study differences in anxiety and related behavioral dimensions (e.g. fear, susceptibitilty to stress) in three different rat strains/stocks (i.e. the RHA-I –low anxious-, RLA-I –high anxious- and the N/Nih-HS –genetically heterogeneous- rat stock), as well as to study the associations among these behavioural profiles and differential gene expression in anxiety/fear/stress-related brain areas (i.e. amygdala and hippocampus). We conducted two studies (Study 1, using 128 male rats from those three strains/stocks; Study 2, using 114 male rats) to achieve those objectives, using a behavioural test battery which included: Elevated zero-maze test (unconditioned anxiety), novelty-induced exploratory activity (unconditioned fearfulness or “timidity” in a “Novel cage”), Open field test, context-conditioned fear (freezing), acquisition of two-way active avoidance in a shuttle box (instrumental aversive learning mediated by conditioned anxiety/fear, due to the double “passive avoidance/active avoidance” conflict) and forced swimming test (“depressive-related” symptoms: a model for the screening of antidepressant drugs). Baseline and post-stress (i.e. 20-min exposure to a novel cage) hormone measurements (ACTH, corticosterone and prolactin) were also obtained in Study 1. Following the behavioural and hormonal analyses of both studies a gene expression study (Study 3) was carried out. Thus, in Study 3, differential gene expression was assessed (through microarray analysis and qRT-PCR) in amygdala and hippocampus from subgroups of N/Nih-HS rats selected (from Study 1) according to their “low anxiety” or “high anxiety” behavioural profiles. From the analyses of the different studies we can conclude that: a) regarding their anxiety/fearfulness, passive coping style, “depressive-like” and stress-induced hormonal responses, the N/Nih-HS rats resemble the phenotype profiles of the relatively high-anxious and stress-prone RLA-I rat strain; b) the characteristic genetic heterogeneity of the N/Nih-HS rat stock, and the microarray gene expression results, point to that rat stock as an useful animal model to study the genetic basis of anxiety and fear; c) microarray analysis detected differential expression (between the above mentioned subgroups of N/Nih-HS rats with extreme low or high anxiety) of genes involved in the regulation of neuroendocrine functions, such as prolactin, arginine-vasopressin and oxytocin, which could participate in the modulation on anxiety and fear responses. d) Microarray analysis also detected differential expression of sensory receptor genes, opioid receptor genes (i.e. Oprd1 and Oprl1), immunity-related genes (like H2-M9) and thyroid regulatory genes, like TRH and Tg (hippocampus) and Duox 2 (amygdala).