Identificació de biomarcadors precoços de nefrotoxicitat induïda per fàrmacs anticalcineurínics

Abstract

El transplantament renal ha suposat una millora significativa de la qualitat de vida dels pacients amb dany renal crònic. Tot i això, l’empelt acaba perdent funcionalitat i es desenvolupa una patologia anomenada nefropatia crònica de l'empelt (CAN). Les causes d’aquesta patologia poden ser el rebuig immunològic de l’empelt renal o d’altres lesions com les causades per la isquèmia-reperfusió pròpies del procés quirúrgic o les degudes al propi tractament immunosupressor amb fàrmacs anticalcineuríncs (CNIs), Ciclosporina A (CsA) o FK-506. Els mètodes de mesura de la funció renal tradicionals com ara els nivells de creatinina en sèrum i la taxa de filtració glomerular, no permeten fer un diagnòstic de disfunció renal a l’inici i precís que permeti distingir el dany causat per factors immunològics dels no immunològics, com per exemple la nefrotoxicitat per fàrmacs CNIs. Per aquest motiu, l’objectiu d’aquesta tesi és la identificació de proteïnes diferencialment secretades per cèl•lules tubulars humanes en cultiu sotmeses a diferents noxes en condicions subtòxiques (CsA, FK506, Rapamicina i Staurosporina). La hipòtesi de treball és que, potencialment, aquestes proteïnes podrien ser detectades en sang i orina de pacient trasplantats i ser útils com a biomarcadors primerencs específics de la nefrotoxicitat causada per fàrmacs CNIs. S'han obtingut mapes proteòmics de les proteïnes secretades (secretomes) en cada condició subtòxica i s’han determinat les proteïnes diferencialment secretades en cada cas. Entre les proteïnes específicament secretades per CsA i/o FK-506 hem analitzat la vàlua de dues d’elles com a biomarcador de dany renal per CNIs: Plasminogen activator-inhibitor-1 (PAI-1), diferencialment secretada per CsA, i Fascina-1, secretada per efecte d’ambdós fàrmacs CNIs. La mesura dels nivells de PAI-1 en sang i orina de pacients trasplantats de ronyó no ha resultat ser útil per detectar dany renal per fàrmacs CNIs. En canvi, hem observat que l’aparició de Fascina-1 en orina de pacients trasplantats de ronyó i de pulmó sembla indicar disfunció renal precoç produïda per fàrmacs CNIs. També, hem detectat Fascina-1 en exosomes urinaris de pacients trasplantats de ronyó fet que permet explicar l’aparició d’una proteïna dels citoesquelet al medi extracel•lular. Els resultats obtinguts suggereixen que l’alliberació al medi de Fascina-1 induïda per fàrmacs CNIs és depenent de l’activació de la proteïna quinasa C.

Renal transplantation has led to a significant improvement in the quality of life of patients with chronic kidney disease. However, over the years the graft loses functionality and develops a pathology called Chronic Allograft Nephropathy (CAN). The causes of this condition can be immune rejection of the graft or other injuries such as those caused by ischemia-reperfusion resulting from the surgical procedure itself or due to the Calcineurin Inhibitor (CNI) immunosuppressive treatment with Cyclosporine A (CsA) or FK-506. The traditional methods of measurement of renal function such as serum levels of creatinine and glomerular filtration rate, do not allow a diagnosis of renal dysfunction at the beginning and accurate enough to distinguish between the damage caused by immunological and non immunological factors such as CNI induced nephrotoxicity. For this reason, the aim of this thesis is the identification of proteins differentially secreted by human tubular cells in culture under different noxious treatments (CsA, FK506, Rapamycin and Staurosporine) at sublethal conditions. The working hypothesis is that, potentially, these proteins could be detected in blood or urine of transplanted patients and be useful as specific biomarkers of early nephrotoxicity caused by CNIs. Proteomic maps were obtained of secreted proteins (secretome) in each sublethal condition and differentially secreted proteins were determined in each case. Among the proteins specifically secreted by CsA and/or FK-506 we have analyzed the value of two of them as a biomarker of CNI induced kidney damage: Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), differentially secreted by CsA, and Fascin-1, secreted by the effect of both CNI drugs. Measuring the levels of PAI-1 in blood and urine of kidney transplant patients has not proved useful for detecting CNI induced nephrotoxicity. However, we found that the appearance of Fascin-1 in urine of kidney and lung transplanted patients could be indicating early renal dysfunction caused by CNIs. Moreover, we found Fascin-1 in urinary exosomes from kidney transplanted patients. This fact helps explaining why a cytoskeleton derived protein appears in the extracellular medium. The obtained results suggest that the release into the environment of Fascin-1 induced by CNIs is dependent on the activation of Protein kinase C.