Biomarcadores en el diagnóstico y tratamiento de la miastenia

Abstract

El descubrimiento de los anticuerpos contra el receptor de acetilcolina (RACh) y la kinasa específica de músculo (MuSK), proteínas de la unión neuromuscular, ha ayudado a entender la fisiopatología de la miastenia y a definir subgrupos de pacientes con un fenotipo clínico común. En esta tesis nos propusimos estudiar si más allá de su utilidad en el diagnóstico, la presencia de anticuerpos específicos tiene implicaciones en la predicción de la respuesta al tratamiento. Analizamos la respuesta clínica e inmunológica a largo plazo en pacientes con miastenia refractaria a otros tratamientos inmunosupresores tratados con rituximab, y comparamos la respuesta observada entre pacientes con miastenia RACh+ y miastenia MuSK+. Por otro lado, estudiamos la presencia de nuevos autoanticuerpos en pacientes con miastenia seronegativa (aquellos en los que no se detectan anticuerpos contra RACh o MuSK). El primer estudio incluyó 17 pacientes (11 con miastenia RACh+ y 6 con miastenia MuSK+). Registramos los cambios clínicos, de tratamiento y en los títulos de anticuerpos de forma periódica tras la administración del tratamiento con rituximab. El segundo estudio incluyó 93 pacientes con miastenia seronegativa, 104 con miastenia seropositiva (71 RACh+ y 33 MuSK+) y 112 controles, incluyendo pacientes con otras enfermedades inmunomediadas o degenerativas y controles sanos. Para identificar nuevas dianas antigénicas, utilizamos una gran variedad de técnicas experimentales para detectar la reactividad del suero sobre diferentes fuentes de antígenos, como la unión neuromuscular de ratón, proteínas neuronales de rata y un extenso array de proteínas humanas.

En el estudio de pacientes con miastenia refractaria, seropositiva, observamos que el tratamiento con rituximab mejora el estado clínico e inmunológico de los pacientes. La mejoría es drástica y de larga duración en los pacientes con miastenia MuSK+ comparado con los pacientes RACh+. En vista del beneficio observado a largo plazo, recomendamos el uso de rituximab como opción terapéutica precoz en los pacientes con miastenia MuSK+ que no responden al tratamiento inicial con prednisona. En cambio, en pacientes con miastenia RACh+ la respuesta menos marcada sugiere que el tratamiento con rituximab se reserve para cuando otros inmunosupresores fallan. En el estudio de pacientes con miastenia seronegativa, identificamos cortactin, una proteína que promueve el agrupamiento de los RACh, como antígeno nuevo utilizando un array de proteínas humanas. Detectamos anticuerpos contra cortactin en un subgrupo de pacientes con miastenia seronegativa utilizando el ensayo celular. Sin embargo, utilizando inmunoblot o ELISA, encontramos que la presencia de anticuerpos contra cortactin no es específica de miastenia. Detectamos estos anticuerpos en algunos pacientes con otras enfermedades inmunomediadas, neurológicas o sistémicas. Así, cortactin parece ser un marcador de autoinmunidad que podría tener valor en el diagnóstico y el tratamiento de pacientes con miastenia seronegativa. Por otro lado, identificamos dipeptidil-peptidasa 10 (DPPY), una subunidad reguladora del canal de potasio Kv4.2, como antígeno nuevo en una paciente con miastenia seronegativa y timoma, lo que sugiere que el repertorio antigénico en la miastenia seronegativa es amplio.

The discovery of antibodies against acetylcholine receptor (AChR) and muscle specific kinase (MuSK), proteins of the neuromuscular junction, has helped to understand the pathophysiology of myasthenia and to define subgroups of patients with a common clinical phenotype. In this thesis we aimed to study if beyond their diagnostic utility, the presence of specific antibodies has implications in predicting treatment response. We analyzed the clinical and immunologic long-term outcome of patients with drug-resistant myasthenia treated with rituximab, and compared the response observed between patients with AChR+ myasthenia and MuSK+ myasthenia. Moreover, we studied patients with seronegative myasthenia (those with non-detectable AChR or MusK antibodies) for the presence of new autoantibodies. The first study included 17 patients with drug-resistant myasthenia (11 AChR+ and 6 MuSK+). Clinical status and changes in treatment and antibody titers were periodically determined after rituximab treatment. The second study included 93 patients with seronegative myasthenia, 104 with seropositive myasthenia (71 AChR+ and 33 MuSK+), and 112 controls including patients with different immune-mediated and degenerative diseases or healthy controls. To identify new target proteins, a variety of experimental techniques were used to detect serum reactivity against diverse sources of antigens such as mouse neuromuscular junction, rat neuronal proteins and a large array of human proteins. In the study of patients with drug-resistant seropositive myasthenia we showed that treatment with rituximab improves the clinical and immunological status. The improvement was dramatic and long-lasting in the MuSK+ group compared to the AChR+ group. In view of the long-term benefit observed, we recommend the use rituximab as an early therapeutic option in patients with MuSK+ myasthenia if they do not respond to initial treatment with prednisone. However, in patients with AChR+ myasthenia, the less dramatic response suggests that rituximab should be reserved for when other immunosuppressants fail. In the study of patients with seronegative myasthenia we identified cortactin, a protein that promotes AChR clustering, as a new antigen using a human protein array. Antibodies against cortactin were detected in a subgroup of patients with seronegative myasthenia using a cell-based assay. However, using immunoblot or ELISA we found that antibodies against cortactin were not specific to myasthenia. These antibodies were detected in some patients with other immune-mediated neurologic or systemic diseases. Thus, cortactin appears to be a marker of autoimmunity that may have diagnostic and therapeutic value in patients with seronegative myasthenia. Moreover, we identified dipeptidyl-peptidase 10 (DPPY), a regulatory subunit of the Kv4.2 potassium channel, as a new antigen in a patient with seronegative myasthenia and thymoma, suggesting a wider repertoire of antigen reactivity in seronegative myasthenia.