Estudio de la inflamación endometrial postinseminación con semen congelado en la burra catalana y posibilidades de control

Abstract

El burro catalán es una raza en peligro de extinción. Las biotecnologías reproductivas son una herramienta estratégica para la conservación de recursos genéticos de especies amenazadas, pero el éxito de su aplicación ha sido limitado por la falta de estudios básicos sobre los aspectos reproductivos y la ausencia de protocolos estandarizados para estas especies. La fertilidad del semen congelado tras la inseminacion artificial en burros es muy escasa, aún cuando las características de calidad del semen a la descongelación han demostrado ser adecuadas. Esta tesis doctoral tuvo como objetivo evaluar la respuesta inflamatoria del endometrio de la burra tras la IA con semen congelado/descongelado. En el primer trabajo se determinaron las características del endometrio de la burra en celo, post-IA con semen congelado/descongelado y se evaluó el efecto del ketoprofen como tratamiento anti-inflamatorio durante el protocolo de inseminación. Se encontraron diferencias histológicas del endometrio de la burra con respecto a la yegua, como la presencia de eosinófilos en todos los grupos experimentales sin relación con otros cambios inflamatorios o degenerativos; concluyendo que estas células parecen ser una característica normal del endometrio de la burra sana. El ketoprofen presentó una eliminación rápida y escasa distribución aparente. Su mecanismo de acción sobre endometrio inflamado de la burra fue la inhibición de la expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) principalmente en el estrato compacto, sin influir sobre la cantidad de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) producidos tras la IA. En el segundo estudio se evaluó el efecto in Vitro del plasma seminal (PS) sobre los espermatozoides y los PMN endometriales. Se incubaron secreciones uterinas obtenidas a las 6 h de IA con semen congelado; con muestras de semen fresco, fresco diluido y congelado durante 4 h. La presencia de PS en el semen fresco y diluido moduló la respuesta inflamatoria, observando una menor cantidad de complejos PMN-espermatozoides, con liberación de algunos espermatozoides atrapados y además se mantuvieron por un mayor tiempo las características iniciales de motilidad del semen comparado con el semen congelado. Finalmente, se determinó el efecto in Vivo del PS sobre el endometrio de la burra post-IA con semen congelado/descongelado. La administración intrauterina de PS autólogo inmediatamente después de la IA, inhibió significativamente la expresión de COX-2 tanto en la capa luminal como en el estrato compacto hasta el punto en que no se encontraron diferencias con las muestras del endometrio no inflamado en estro (control). El PS no influyó sobre el número de PMN producidos por la inseminación artificial pero la expresión de COX-2 se correlacionó con el número de PMN de citologías y biopsias, por tanto, la quimiotáxis de PMN pudo haber sido reducida por esta vía. En conclusión, la burra sana parece ser más susceptible que la yegua a desarrollar endometritis tras la inseminación con semen congelado, posiblemente debido a las diferencias tanto histológicas como anatómicas de su tracto reproductivo. También existen diferencias en la disposición farmacológica del ketoprofen en el burro. Estos aspectos, así como el papel modulador tanto in Vitro como in Vivo del PS observado en las interacciones PMN-espermatozoides en el burro catalán, deben seguir siendo investigados para la optimización del protocolo de IA con semen congelado en burros, con el fin de mejorar los resultados de fertilidad de esta tecnología reproductiva.

The Catalan donkey is an endangered breed. Reproductive technologies constitute a strategic tool for the conservation and maintenance of the genetic resources of endangered populations but their successful application has been limited by scarcity of basic studies in reproduction and absence of standardized protocols. Fertility rates achieved by artificial insemination (AI) with frozen semen in donkeys are disappointingly low, despite the apparently adequate quality of the thawed semen. Nevertheless, fertility is not only dependent on the male, but also on the female reproductive physiology. Hence, the aim of this doctoral thesis was to evaluate the endometrial inflammatory response after insemination with frozen/thawed semen in the Jenny, with a view to help enhance fertility rates with frozen semen in donkeys. In the first study, the endometrial characteristics of the Jenny were evaluated in estrous (control), both after-AI with frozen/thawed semen and after-AI with ketoprofen administered as anti-inflammatory treatment. In contrast to mare, the presence of eosinophils in all experimental groups without any relation to other inflammatory or degenerative changes indicated that they could be a normal feature of a healthy Jenny endometrium. On the other hand, ketoprofen was rapidly eliminated of blood and had a poor apparent tissular distribution. Its mechanism of action in the inflamed endometrium was cyclooxigenase-2 (COX-2) inhibition, which was observed mainly in the stratum compactum, and had no effect on the number of polimorphonuclear neutrophils (PMN) produced after-AI. In the second study, the in Vitro effect of seminal plasma (SP) over sperm and endometrial PMN was determined. Uterine secretions obtained 6 h after-AI were incubated with samples of fresh pure, fresh diluted and frozen/thawed donkey semen during 4 h. Frozen semen showed a major lost of progressive motility and more number of PMN-sperm aggregates than fresh pure and fresh diluted semen where SP was present. Thus, a modulating effect of SP on endometrial inflammation over PMN and sperm was observed in Vitro. Finally, the in Vivo effect of SP in the Jenny endometrium after-AI with frozen/thawed semen was determined. Intrauterine administration of pre-warmed autologous SP immediately after-AI, inhibited COX-2 expression both in the luminal epithelium and stratum compactum at 6 h of insemination, to the point that there were no differences with the non-inflamed endometrium in estrous (control). The number of PMN produced 6 h after-AI was not affected by SP but COX-2 expression was correlated with PMN observed both in cytology and biopsies, so, PMN chemotaxis might actually have been reduced by this via. In conclusion, it seems that healthy Jenny is more susceptible than healthy mare to develop endometritis by AI with frozen semen, ostensibly, due to histological, physiological and anatomical differences in the reproductive tract. There are also pharmacologic differences on drug disposition (ketoprofen) in donkeys. These aspects, as well as the in Vitro and in Vivo modulator effects of SP over the PMN-sperm interactions observed in the Catalan donkey, should be further studied to optimize the insemination protocol with frozen semen in donkeys and improve the fertility rates of this reproductive technology.