Novel Modes of Regulation of Cyclin Dependent Kinase Cdk1

Abstract

Les quinases dependents de ciclina (CDKs) dirigeixen la progressió del cicle cel·lular a les cèl·lules eucariotes. A l’organisme eucariota model Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació) una sola quinasa dependent de ciclina, Cdk1, és essencial i suficient per dirigir el cicle cel·lular. Unida alternativament a ciclines de fase G1, S i G2/M, Cdk1 regula els programes transcripcionals del cicle cel·lular, la replicació i segregació dels cromosomes, la dinàmica del fus mitòtic, el creixement cel·lular polar, la morfogènesi, etc. La desregulació de l’activitat CDK promou la proliferació descontrolada i la inestabilitat genòmica. Donada la seva funció essencial en la progressió del cicle cel·lular, Cdk1 és estretament regulada per proteïnes associades (les ciclines, Cks1, i inhibidors de les CDKs –CKIs) i per modificacions post-traduccionals. Tanmateix, molts detalls de la regulació de Cdk1 romanen desconeguts, com és el cas de com les activitats CDK de fase G1 o de fase M són inhibides en resposta a determinats estressos cel·lulars. Quan la progressió del cicle cel·lular és amenaçada per la presència d’estressos genotòxics tals com l’estrès replicatiu o la presència de dany al DNA, un mecanisme de vigilància, l’anomenat checkpoint de la fase S, s’activa per tal de protegir la integritat del genoma. Al llevat de gemmació, el checkpoint de la fase S és mediat per la quinasa Mec1 (ATR/ATM a humans) i la seva quinasa efectora Rad53 (Chk2 a humans). Per explorar si la quinasa efectora Rad53 regula Cdk1 en resposta a estrès genotòxic, hem explorat dues qüestions principals: (1) la fosforilació de Cdk1 per Rad53 i (2) la regulació per Rad53 de proteïnes associades a Cdk1. Pel que fa a la primera qüestió, aprofitant un assaig quinasa in vitro amb Rad53, mostrem que Cdk1 és fosforilat directament per Rad53. Hem identificat proteòmicament dos llocs de Cdk1 (Ser46, Ser258) fosforilats per Rad53 in vitro. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel no-fosforilable (Cdk1-2A) mostren un fenotip wee, compatible amb una activitat CDK incrementada/desregulada. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel fosfomimètic (Cdk1-2E) són allargades i més grans que les cèl·lules silvestres, compatible amb una activitat CDK reduïda. A més, assignem i quantifiquem les diferents formes fosforilades de Cdk1 in vivo mitjançant electroforesi Phos-tag. Respecte la segona qüestió, hem identificat proteòmicament proteïnes associades a Cdk1 en presència d’estrès replicatiu en forma dependent de Rad53. Hem estudiat en detall el producte del gen de funció desconeguda YPL014W, que bategem Cip1 (per Cdk1 Interacting Protein 1), que obté la puntuació més alta en l’anàlisi. Les nostres dades mostren que Cip1 és una proteïna regulada al llarg del cicle cel·lular. A més, l’abundància de Cip1 s’incrementa en forma dependent de Rad53 en presència d’estrès replicatiu. La sobre-expressió de Cip1 bloqueja les cèl·lules a fase G1 i estabilitza el CKI de fase S Sic1 in vivo. A més, Cip1 interacciona específicament amb el complex de fase G1 Cln2-Cdk1, però no amb el complex de fase S Clb5-Cdk1 or el de fase M Clb2-Cdk1. Cip1 inhibeix l’activitat Cln2-CDK tant in vivo com in vitro. Els nostres resultats suggereixen que Cip1 pot ser un nou CKI de l’activitat CDK de fase G1.

Cyclin dependent kinases are drive cell division cycle progression in eukaryotic cells. In the model eukaryotic organism Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) a single Cyclin Dependent Kinase, Cdk1, is essential and sufficient to drive the cell cycle. Alternately bound to G1, S and G2/M phase cyclins, Cdk1 regulates cell cycle transcriptional programs, chromosome replication and segregation, spindle dynamics, polarized cell growth, morphogenesis, etc. Misregulated CDK activity induces unscheduled proliferation as well as genomic instability. Given its essential function in cell cycle progression, Cdk1 is tightly regulated by binding partners (cyclins, Cks1 and Cyclin dependent Kinase Inhibitors -CKIs) and post-translational modifications. However, many details on Cdk1 regulation remain unknown, such as how G1 or mitotic CDK activities are inhibited in response to challenging conditions. When the cell cycle progression is challenged by genotoxic stress such as DNA replication stress or DNA damage, a surveillance mechanism, the S phase checkpoint is activated to protect the integrity of the genome. In the budding yeast the S phase checkpoint is mediated by the Mec1 kinase (ATR/ATM in humans) and its downstream effector kinase Rad53 (Chk2 in humans). To explore whether the effector kinase Rad53 regulates Cdk1 in response to genotoxic stress, we have been exploring two main avenues: (1) Cdk1 phosphorylation by the S phase checkpoint effector kinase Rad53 and (2) Rad53 dependent regulation of Cdk1 associated factors. With respect to the first question, taking advantage of a Rad53 in vitro kinase assay, we show that recombinant Cdk1 is directly phosphorylated by Rad53. We also proteomically identified two sites of Cdk1 (Ser46, Ser258) phosphorylated by Rad53 in vitro. Cells carrying the non-phosphorylatable Cdk1 allele (Cdk1-2A) display a wee phenotype, compatible with increased/unrestrained CDK activity. Cells carrying the phosphomimetic Cdk1 allele (Cdk1-2E) are elongated and larger in size than wild type cells. Moreover, we also assign and quantify the different phosphorylation forms of Cdk1 in vivo using Phos-tag electrophoresis technology. With respect to the second question, we have proteomically identified proteins associated with Cdk1 in the presence of replication stress in a Rad53 dependent manner. The product of the unknown function gene YPL014W, which we name Cip1 (for Cdk1 Interacting Protein 1), with the highest score, is further studied. Our data shows that Cip1 is a cell cycle regulated protein. In addition, the abundance of Cip1 increases in a Rad53 dependent manner upon DNA replication stress. Overexpression of Cip1 blocks cells in G1 and stabilizes the S-phase-Cdk1 inhibitor Sic1 in vivo. Moreover, Cip1 specifically interacts with G1 phase Cln2-Cdk1 but not with S phase Clb5-Cdk1 or M phase Clb2-Cdk1. Cip1 inhibits Cln2-CDK activity both in vivo and in vitro. Our finding suggests that Cip1 may be a novel CKI of G1 phase CDK activity.