Analysis of host responses and fitness in different pandemic H1N1 (2009) influenza virus in mice and ferrets

Abstract

La gripe es un problema de salud pública en todo el mundo, siendo una de las enfermedades infecciosas más comunes y una patología de las vías aéreas altamente contagiosa. Desde abril de 2009, un nuevo virus de influenza A H1N1, con origen porcino dio lugar a la aparición de brotes en todo el mundo siendo declarada posteriormente como una situación de pandemia. Hoy en día el virus pdmH1N1 de 2009 continúa en circulación, generalmente provocando infecciones leves y autolimitadas. Sin embargo, un pequeño porcentaje de pacientes requieren hospitalización y atención especializada en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI). Es digno de mención comentar que se ha identificado un aumento en la producción de citoquinas proinflamatorias en pacientes de UCI. Esta observación sugiere la hipótesis de que la heterogeneidad en el resultado de la infección por virus de la gripe pdmH1N1 de 2009 podría ser debido no sólo a la diferencia entre fitness /virulencia de las diversas cepas de virus pandemico circulantes, sino también por el medio ambiente inmune del huésped que pueden contribuir a la patogénesis respiratoria grave, probablemente por una respuesta inmune exacerbada asociada a hipercitoquinemia. Para probar esta hipótesis el presente trabajo se divide en cuatro estudios que describen los experimentos realizados en ratones y hurones con los virus pdmH1N1 de 2009 aislados durante el brote de 2009 de pacientes que mostraron grados de enfermedad desde leve a severa con el fin de analizar las características patológicas de la infección. Los experimentos en los capítulos 5 y 6 se llevaron a cabo con el fin de evaluar si los altos niveles de citoquinas proinflamatorias y, en particular IL-6, podrían afectar a la respuesta inmune del huésped y al curso clínico de la infección. Los ratones fueron tratados con LPS o ratones que expresaron altos niveles de IL-6 fueron infectados con el virus pdmH1N1 de 2009 (CAT09) simultáneamente. En el caso de la exposición a LPS, los resultados mostraron que los signos clínicos y la pérdida de peso fueron directamente influenciadas por LPS en los animales infectados con CAT09. Sin embargo, no se detectaron diferencias en la carga viral de los pulmones de los ratones infectados con exposición de LPS, lo que indica que el tratamiento con LPS no estaba afectando a la replicación viral in vivo. La secreción de IL-6 después de la exposición a LPS correlacionó con pérdida de peso corporal a mayor grado de patología. El papel de la IL-6 en la infección por influenza se abordó mediante la inducción de IL-6 en ratones antes de ser infectados con CAT09. Una vez más, los niveles de IL-6 se correlacionaron con la pérdida de peso. Sorprendentemente, la replicación viral no fue afectada por altos niveles de IL-6 debido a que la carga viral no mostró diferencias significativas cuando se compararon los dos grupos infectados, aunque los animals infectados con alto nivel de IL-6 aclararon el virus antes que los animales infectados con CAT09. Se detectó una fuerte respuesta de anticuerpos en los animales infectados, siendo los ratones infectados sólo con CAT09 sin tratamiento con IL-6, los que obtuvieron los mayores títulos de inhibición de hemaglutinación. IL-10 correlacionó con los niveles de IL-6 en el suero y en los pulmones en los primeros días después de la infección. Finalmente, las lesiones histopatológicas fueron más graves en los ratones con altos niveles de IL-6 e infectados con CAT09. Desde el inicio de la pandemia de 2009, mutaciones de resistencia a oseltamivir (OsR) se han descrito en virus circulante pdmH1N1 de 2009. En el capítulo 7 estudios in vitro e in vivo en el que se compararon dos cepas (R6 y R7) de virus pandémico OsR. Hubo diferencias in vitro en la cinética de ambos virus que finalmente se reflejó en la patogénesis de la infección in vivo. Los resultados obtenidos en el análisis in vitro mostraron diferencias en el fitness en la replicación viral de los virus estudiados respecto a un virus sensible a oseltamivir (F), siendo F > R6 > R7. En el siguiente experimento in vivo, ambas cepas OsR produjeron un resultado fatal aunque en diferente magnitud y cinética; el grupo infectado con R6 experimentó un 40 % de letalidad y el grupo R7 un 20 % a los 4 dpi. Sin embargo, a 7 dpi el porcentaje de supervivencia fue de un 50 % para ambos grupos infectados con virus OsR. La replicación viral detectada en los pulmones de los grupos infectados con virus OsR obtuvo los valores no estadísticamente diferentes para R7 que para R6. Hubo una fuerte respuesta de anticuerpos a los 14 dpi en ambos grupos infectados para cada virus, pero no anticuerpos de reacción cruzada. Curiosamente, se detectaron altos niveles de IL-6 en el suero de los ratones R7 con diferencias significativas. Sorprendentemente, los niveles de IL-6 en los pulmones de R6, R7 y animales control fueron similares a todos los tiempos sin diferencias estadísticas. Niveles de IL-10 de suero y pulmón mostraron valores ligeramente más altos también en ratones R7 en comparación con los controles a los 3 y 5 dpi, respectivamente. Hallazgos histopatológicos mostraron lesiones más severas en ratones R7 a 5 dpi.

Para analizar las posibles diferencias de virulencia, se infectaron hurones con dos virus pdmH1N1 de 2009 de dos pacientes sin condiciones comórbidas conocidas, uno con consecuencia fatal (F), mientras que el otro sólo mostró enfermedad respiratoria leve (M). Este estudio está comprendido en el capítulo 8. Los hurones desarrollaron diferente grado de severidad de signos clínicos que no se correlacionaron con el origen del virus utilizado en la infección, exhibiendo patología severa (S) o no severa (NS). Se detectó una disminución significativa en el peso corporal en los animales S en comparación con los animales NS a 4 a 7 dpi. La evolución clínica de la infección se relaciono directamente con los hallazgos histopatológicos. El análisis de las proteínas de fase aguda mostró que las concentraciones de haptoglobina (HP) y amiloide A sérico (SAA) incrementaron en ambos grupos después de 2 pi. Los títulos de virus en todos los tejidos fueron más altos en los hurones pertenecientes al grupo S en comparación con los hurones pertenecientes al grupo de NS a 4 dpi. Los animales infectados con ambos virus mostraron una fuerte inhibición de la hemaglutinina de la respuesta de anticuerpos en el suero de ambos virus a 10 y 14 dpi. Los hurones con un progreso severo de la infección clínica mostraron respuestas de anticuerpos ligeramente más altos y los títulos virales más altos después de la infección.

Influenza is a worldwide public health concern, being one of the most common infectious diseases and a highly contagious airborne pathology. From April 2009, a new influenza A H1N1 virus with swine origin gave rise to the emergence of worldwide outbreaks which was subsequently declared as a pandemic situation. Nowadays pdmH1N1 2009 virus continues on circulation and generally triggers mild and self-limiting infections. Nevertheless, a small percentage of the patients require hospitalization and specialized attention in Intensive Care Units (ICUs). Noteworthy, in ICU patients an increased proinflammatory cytokine production has been identified. This observation would suggest the hypothesis that the heterogeneity in the outcome of pdmH1N1 2009 influenza virus infection could be due not only to differential fitness/virulence of the diverse circulating pandemic virus strains but also to the host immune environment that may contribute to severe respiratory pathogenesis, probably by an exacerbated immune response associated to hypercytokinemia. To test such hypothesis the work was divided in four studies describing the experiments performed in mice and ferrets with pdmH1N1 2009 viruses isolated during the 2009 outbreak from patients that showed mild to severe disease in order to analyse pathological features of the infection. Experiments in chapters 5 and 6 were conducted in order to evaluate whether high levels of proinflammatory cytokines and in particular IL-6, might affect host immune responses and the clinical course of infection. Mice were treated with LPS or mice expressing with high levels of IL-6 were infected with pdmH1N1 2009 (CAT09) simultaneously. In the case of LPS exposure, results showed that clinical signs and weight loss were directly influenced by LPS in CAT09 infected. However, no differences in viral load of lungs from infected mice were detected upon LPS exposure, indicating that LPS treatment was not affecting viral replication in vivo. IL-6 secretion upon LPS exposure correlated with body weight loss and higher pathology.

The role of IL-6 in influenza infection was addressed by inducing IL-6 in mice prior CAT09 infection. Again, IL-6 levels correlated with weight loss. Surprisingly, viral replication was not affected by high levels of IL-6 since viral load did not exhibit significant differences when both infected groups were compared, although high level of IL-6 in infected animals correlated with sooner viral clearance than the CAT09 infected animals. A strong antibody response was detected in infected animals, being only CAT09 infected mice without IL-6 treatment, the ones with the highest hemagglutinin inhibiting titers. IL-10 levels correlated with IL-6 levels in serum and lungs in the first days after infection. Finally, histopathological lesions were more severe in mice with high levels of IL-6 and CAT09 infected. From the onset of the 2009 pandemic, oseltamivir resistance (OsR) mutations have been described on circulating pdmH1N1 2009 viruses. In chapter 7, in vitro and in vivo experiments in which two strains (R6 and R7) of OsR pandemic virus were compared. There were kinetics differences in both virus in vitro that finally were reflected in the pathogenesis of infection in vivo. The results obtained in the in vitro analysis showed different fitness in viral replication in the virus studied in comparison with a oseltamivir sensitive virus (F), being F>R6>R7. On the following in vivo experiment, both OsR strains produced a fatal outcome although with different magnitude and kinetics, R6-infected group experimented a 40% of lethality and R7-group a 20% at 4 dpi. However, at 7 dpi the percentatge of survival was a 50% in both OsR-infected groups. Viral replication detected in lungs from OsR-infected groups had higher but not statistically different values for R7 than for R6. There was a strong antibody response at 14 dpi on both infected groups for each virus but no cross- reactive antibodies. Interestingly, high levels of IL-6 were detected in serum from R7-mice with significant differences. Surprisingly, levels of IL-6 in lungs of R6, R7 and control animals were similar at all time-point with no statistical differences. Serum and lung IL-10 had also slightly higher values in R7-mice when compared with controls at 3 and 5 dpi respectively. Histopahological findings showed more severe lesions on R7-mice at 5 dpi. To analyze possible virulence differences in viral fitmess, ferrets were infected with two contemporary pdmH1N1 2009 viruses from two patients without known co-morbid conditions, one that became fatal (F) while the other only showed mild (M) respiratory disease. These were studied in chapter 8. Ferrets developed different degree of clinical signs severity that did not correlate with the origin of the virus used in the infection, exhibiting severe (S) or non severe (NS) pathology. A significant decrease in body weight was detected in S animals compared to NS animals at 4 to 7 dpi. Clinical progress of the infection correlated directly with histopathological findings. The analysis of the acute phase proteins showed that the concentrations of haptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) increased in both groups after 2 dpi. Virus titres in all tissues were higher in ferrets belonging to S group when compared to ferrets belonging to NS group at 4 dpi. Animals infected with both virus showed a strong hemagglutinin inhibiting antibody response in sera to both viruses at 10 and 14 dpi. Ferrets with a severe progress of the clinical infection showed slightly higher antibody responses and higher viral titers after infection.