Estudio de la vía de señalización de RANK y RANKL en células de mama humanas y generación de ortoxenopacientes de càncer de mama

Abstract

Este proyecto de tesis doctoral se ha centrado en tres objetivos principales: el primero es el estudio de la función de la vía de señalización de RANK-RANKL-OPG en el desarrollo y progresión del cáncer de mama en humanos. El segundo es el análisis de la expresión de RANK en muestras de tumores humanos y análisis modificaciones en el gen que afecten en la incidencia de cáncer de mama en humanos. El tercero es la generación de modelos ortotópicos de ratón de cáncer de mama humano que sirvan como herramienta para la caracterización de nuevas dianas terapéuticas así como para testar la eficacia de nuevas drogas dirigidas a pacientes de cáncer de mama resistente a los tratamientos ya existentes. Respecto al primero objetivo, los resultados obtenidos indican que la sobre-expresión de RANK en células epiteliales de mama humanas no transformadas MCF10A induce la adquisición de un fenotipo asociado al proceso de transición epitelio-mesenquina (EMT) así como la adquisición de un fenotipo característico de células madre. El mecanismo por el cual la sobre-expresión de RANK induce EMT está relacionado con el aumento de la producción del factor de crecimiento transformate beta (TGF-beta) mediante la activación de las vías de señalización del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB) y la proteína quinasa activada por mitógenos p38. La inducción del fenotipo de célula madre está asociado a la activación de vía de señalización de las quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2 (ERK 1/2). Los resultados referentes al segundo objetivo indican que en muestras de pacientes humanos, los niveles de expresión de RANK son más elevados en tumores con un peor pronóstico clínico (fenotipo triple negativo, alto índice de proliferación y algo grado histológico) y mediante la expresión de los niveles de mARN de RANK y RANKL se puede diferenciar entre tumores metastáticos y no metastáticos a nódulo linfático. Además, se ha descrito la existencia de un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) presente en la región 5´del gen de RANK que está asociado con una menor probabilidad de padecer cáncer de mama en pacientes que poseen mutaciones en el gen BRCA2 (“breast cancer 2”). Finalmente, en este trabajo se describe la generación de cinco modelos ortotópicos de cáncer de mama a partir de muestras clínicas de pacientes. Estos modelos mantienen las características histológicas de los tumores humanos de origen así como los patrones de metástasis de los pacientes de los que proceden. De los cinco modelos generados, dos tienen unas características histológicas relativas a tumores triples negativos (TNBC), dos a tumores luminales (positivos para la expresión del receptor de estrógenos y progesterona) y uno a tumor Her2+. Los tumores Luminales y Her2+ manifiestan diferentes comportamientos de crecimiento en respuesta a hormonal, siendo un reflejo de los distintos tipos de comportamientos que existen en clínica. Por último, se ha testado la sensibilidad de estos modelos a taxanos (Docetaxel), una de las drogas quimioterapéuticas mas empleadas en la actualidad. Los dos modelos TNBC muestran más sensibilidad a la droga mientras que los modelos hormono-dependientes son resistentes. A partir de un modelo sensible TNBC se ha desarrollado un segundo modelo de ratones resistente a Docetaxel mediante la administración continuada del fármaco. Lo que se pretende en futuros proyectos es emplear estos modelos generados en el estudio de nuevas dianas terapéuticas en cáncer de mama así como testar nuevos fármacos en su fase pre-clínica de desarrollo.

This study has been focused in three main goals: study of RANK and RANKL pathway in the development and progression of human breast cancer; analysis of RANK expression in clinical human samples and analysis in RANK gene modifications implicated in human breast cancer; generation of orthoxenopatients of human breast cancer. The results of first objective showed RANK over-expression in human mammary cells MCF10A induces epithelial-mesenchymal transition (EMT) and Stemness phenotype. The molecular mechanism though RANK induces these effects implicates the increment of transforming growth factor beta (TGF-beta) ligands expression thorugh activation of nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) and mitogen activated kinase protein p38. On the other hand, the induction of Stemnes phenotype implicates the activation of Extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2). The analysis of RANK expression in clinical human samples showed that tumor with a poor prognosis (such as triple negative tumors, tumors with high proliferative index and high histological grade) has higher levels of RANK expression. Moreover, through analysis of RANK and RANKL expression is able discriminate metastatic and non metastatic tumors. In addition, a lower probability to undergo breast cancer in patients with mutations in BRCA2 gene has been correlated with a SNP in the 5´region of RANK gene. Finally, five models of ortothopic mouse models of human breast cancer have been generated. The models obtained were two triple negative, two luminal and one Her2+. These models resemble de histological characteristics of original tumors and the metastasis patterns of the patients. Also the growth rate, latency and dependence to hormones were evaluated in these models. The sensitivity of these tumors was tested to Docetaxel. The triple negative tumors were sensitive whereas Luminal and Her2+ tumors were resistant to Docetaxel. Moreover, resistant models to Docetaxel were generated from sensitive models by continued Docetaxel administration. Samples were collected during the process in order to investigate the mechanisms implicated in resistance acquisition to Decetaxel in the future.