Study of the molecular mechanisms responsible for E2F1-induced Mtorc1 activation

Abstract

The oncogenic properties of E2F1 have been traditionally associated with the role of the oncogene in proliferation, but during the last few years many other functions associated with this family of transcription factors have been emerging. We focused on the study of the oncogenic properties of E2F1 not related to the cell cycle progression. In particular, previous results of our research group demonstrated that the overexpression of mammal E2F1 induces cellular growth by activating the mTORC1 pathway. Taking into account the well known implication of the mTOR pathway in cancer, the general aim of the Thesis is to elucidate the molecular mechanism by which E2F1 regulates mTORC1. This led us to novel observations concerning the ability of E2F1 in regulating V-ATPase activity, intracellular trafficking and autophagy repression. Specifically, we demonstrated that E2F1 enhances the activity of V-ATPase, the major regulator of lysosomal pH. By modulating this activity, E2F1 is capable of regulating lysosomal biology. This leads to the activation of mTORC1, to the relocalization of lysosomes to the cell periphery and to the repression of the autophagy flux. We showed that, similarly to the amino acids signaling, E2F1 activation pro- motes the translocation of mTOR to lysosomes and also induces an increase in the binding of mTORC1 to the lysosomal protein RagB. Our immunofluorescence analysis revealed that mTORC1 activity is not necessary for the peripheral movement of lysosomes regulated by E2F1. However, the depletion of Raptor totally abrogates this response. The ability of E2F1 to act as an autophagy repressor is due to its capacity in driving lysosomes to cell periphery and also in activating mTORC1. Moreover, we identified kinesin KIF2A as a novel transcriptional target of E2F1. Although KIF2A basal levels are required for E2F1-induced mTORC1 activation, the increase in KIF2A levels triggered by E2F1 does not contribute to mTORC1 activation. E2F1 enhances V-ATPase activity, and this modulation is required for E2F1-induced lysosomal trafficking and mTORC1 activation. E2F1 promotes an increase in the binding of the C1 subunit of the V1 domain, ATP6V1C1, to the V-ATPase/RagB lysosomal complex, suggesting that such binding could be the mechanism through which E2F1 enhances V-ATPase activity. Finally, we showed that E2F1 activation leads to a general re-arrangement of the cytoskeleton and that, moreover, is required to promote cell migration. Several studies indicated a high correlation between E2F1 overexpression and metastasis. Our data showing that E2F1 is required for cell migration are in agreement with the theory of E2F1 being a promotor of invasiveness. Taking into account the implication of V-ATPase in cancer, our novel observations concerning the ability of E2F1 to regulate the peripheral movement of lysosomes and to enhance V-ATPase activity help us to better understand the role of E2F1 in invasion and metastasis.

Además de controlar la proliferación celular, E2F1 regula otros procesos biológicos asociados con la progresión del cáncer. En particular, resultados previos de nuestro grupo han demostrado que E2F1 induce el crecimiento celular mediante la activación de la vía de transducción de mTORC1. Teniendo en cuenta el papel central de esta vía en el cáncer, el objetivo de la Tesis ha sido estudiar los mecanismos moleculares que regulan la activación de mTORC1 inducida por E2F1. Este estudio nos ha permitido demostrar que E2F1 es un regulador del tráfico endosomal, de la actividad de la V-ATPase, el principal regulador del pH lisosomal, y de la autofagia. Mediante la activación de la V-ATPase, E2F1 induce la activación de mTORC1, el movimiento de los lisosomas hacia la periferia de la célula y la represión de la autofagia. Nuestros resultados en concreto han demostrado que la sobre-expresión de E2F1 induce la translocación de mTORC1 a los lisosomas y promueve su asociación con la proteína lisosomal RagB. El movimiento periférico de los lisosomas regulado por E2F1 no depende de la actividad de mTORC1, pero requiere la presencia de Raptor. La capacidad de E2F1 de reprimir la autofagia está mediada probablemente por la activación de mTORC1 y el movimiento de los lisosomas hacia la periferia celular. También hemos identificado la kinesina KIF2A cómo una nueva diana transcripcional de E2F1. Aunque esta kinesina es necesaria para la activación de mTORC1, el aumento de los niveles de KIF2A no es responsable de la activación de mTORC1 inducida por E2F1. En paralelo, E2F1 aumenta la actividad de V-ATPasa, y esta modulación es necesaria para la activación de mTORC1 y el tráfico lisosomal inducido por E2F1. E2F1 induce la asociación de RagB con la subunidad C1 V1 de la V-ATPasa (ATP6V1C1). Esta unión podría ser el mecanismo a través del cual E2F1 activa la V-ATPasa y mTORC1. Por último, E2F1 regula el ensamblaje del citoesqueleto y es necesario para la migración celular. Nuestros datos sobre el papel de E2F1 en la migración celular concuerdan con la propiedad ya descrita de E2F1 como un promotor de invasividad. Teniendo en cuenta el rol de la V-ATPase en la invasividad, nuestras observaciones relativas a la capacidad de E2F1 de regular el movimiento periférico de lisosomas y de activar la V-ATPasa nos ayudan a entender el papel de E2F1 en la invasión y metástasis.