Determinació dels paràmetres estructurals d'una glicoproteina amb activitat del grup sanguini A

Abstract

L'activitat de grup sanguini A en els eritròcits, quan aquesta ha estat referida a substàncies no lipídiques, s'ha assignat de forma concreta a la glicoforina A, la glicoproteïna més gran present en la membrana, i també a l'anomenada banda 3 la principal proteïna de l'eritròcit. En altres casos l'activitat de grup sanguini ha estat relacionada amb altres glicoproteïnes sense especificar-ne els trets més característics.<br/><br/>En base a aixó, l'objectiu de la tesi ha estat la caracterització fisico-química i estructura d'una molècula que químicament tingui naturalesa glicoproteïnica, anant acompanyada aquesta d'activitat de grup sanguini A.<br/><br/>Així, a partir de sang de 18 donants sans s'han obtingut les membranes de l'eritròcit per mitjà de la lisi hipotònica. La presència d'activitat acetilcolinesterasa en les membranes indica que les vesícules s'han tancat amb la mateixa orientació que tenien els eritròcits abans de la lisi. Les membranes, un cop homogenitzades, dialitzades i liofilitzades, s'han sotmes al procés de solublització, és a dir, el procés que converteix l'estat complexe de la membrana intacta en un estat més senzill que permeti l'anàlisi dels components de la membrana per mètodes que no poden aplicar-se a la membrana intacta.<br/><br/>Després de realitzar un estudi comparatiu amb tres tècniques solubilitzadores, s'ha escollit la fonamentada amb l'extracció dels lípids per la mescla cloroform-metanoI (2:1, v/v). A continuació, les glicoproteïnes es precipiten de la fase aquosa per adició d'etanol (concentración final del 60 %) i manteniment durant 48 h a -20°C en presència de clorur sòdic.<br/><br/>Les glicoproteïnes es purifiquen per cromatografia de filtració per gel (Sephadex G-75) i per cromatografia d'afinitat fent passar les glicoproteïnes a través d'un gel que contenia la lectina Helix pomatia (Helix pomatia Lectin - Sepharose 6MB), que específicament uneix les glicoproteïnes que porten com a sucre terminal la N-acetil-D-galactosamina, glúcid característic de les glicoproteïnes amb activitat de grup sanguini A.<br/><br/>La glicoproteïna eluïda de la columna per una concentración 0.1 M de N-acetil-D-galactosamina té una capacitat inhibitòria de l'hemaglutinació de 38.82 micrograms/mL, amb una forquilla de 39.43 i 38.21 micrograms/mL, per un Iímlt de confiança alfa=90. L'anàlisi dels aminoàcids i glúcids corresponents ha proporcionat uns percentatges respectius de proteïna i sucres del 41.05 i 58.95. Cal destacar l'alta presència de serina i treonina (aminoàcids que en una glicoproteïna són els que uneixen la cadena glucídica al nucli peptídic), la molt baixa proporció d'aminoàcids cromòfors (triptofan i tirosina), la qual cosa explica que la molècula no presenti una marcada absorció pels voltants dels 280 nm i també justifica el baix valor del coeficiente d'absorció específica (0.4324 L/g. cm). La molècula no conté cisteïna i, per tant, no poden existir enllaços disulfuro intramoleculars. Pel que fa als glúcids, la meitat d'aquestos corresponen a hexosamines, trobant-s'hi també hexoses neutres i àcid siàlic.<br/><br/>La valoració de la glicoproteïna pel mètode clàssic de Lowry presenta una gran pèrdua de sensibilitat envers la que el mètode presenta quan hom valora una proteïna estàndard, com és ara el cas de I'albúmina sèrica bovina.<br/><br/>Per aixó, s'ha desenvolupat un mètode per a quantificar les glicoproteïnes basat en determinar per espargiment de la llum ("light scattering") la turbidesa produïda per l'adició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode per l'afició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode, a més de precís, no és destructiu.<br/><br/>El valor de la masa molecular calculat per a la glicoproteïna ha estat de 53500 ±4280 Da (per light scattering), de 41500 Da (per anàlisi d'aminoàcids) i de 76000 la forma dimèrica i 43000 la monomèrica (per PAGE-SDS). La cromatografia de filtració per gel no és adient per a determinar la masa molecular atès que proporciona valors molt superiors als reals a causa de l'efecte distorsionant de l'àcid siàlic i de la possible capacitat d'autoagregació.<br/><br/>Entre les propietats físico-químiques estudiades (absorció a l'espectre U.V., dependència de la turbidesa amb la longitud d'ona, espectroscòpia derivativa, variación de l'espectre d'absorció a l'U.V. en funció del pH, ionització dels grups fenòlics, absorció a l'espectre I.R., dispersió rotatòria òptica (D.R.O.), comportament cromatogràfic, viscositat, punts isoelèctric i isoiònic, volum específic parcial, increment de l'índex de refracció i solubilitat), destaquen aquelles que proporcionen una més gran informació sobre la molècula, cas de la D.R.O. i de la viscositat. L'espectre de D.R.O. de la glicoproteïna presenta una vall negativa de feble magnitud a 234 nm, mentre que els valors de la viscositat intrínseca i de la constant d'Huggins apunten vers una estructura de la molècula en cabdell monoestadístic ("random coil").<br/><br/>A partir de les característiques estructurals determinades s'ha pogut obtenir que la glicoproteïna té una estructura molt expandida (37.70 nm de radi de gir), que presenta un 50 % de cabdell monoestadístic, un 30 % d'alfa-helix i un 20 % de beta-fulla (segons els valors obtinguts entre 220 i 250 nm, aplicant els tractaments de Greenfield et al. i Chen et al.), i que els aminoàcids cromòfors es troben tant en l'interior com en l'exterior de la molècula (estudi de l'acció dels agents pertorbants no polars: urea, d,ioxà i polietilenglicol). <br/><br/>Finalment, s'ha estudiat per diferents tècniques l'estabilitat estructural de la glicoproteïna enfront del clorhidrato de guanidina, la urea i la calor. Amb els resultats obtinguts pot arribar-se a la conclussió que la glicoproteïna és molt estable; que, a més, l'acció desnaturalitzant és reversible i que el procés de desnaturalització és complexe, no podent ésser identificat amb un procés en dos estats, natiu i desnaturalitzant, com succeeix en moltes proteïnes.

<I>"DETERMINATION OF ESTRUCTURAL PARAMETERS FROM A GLYCOPROTEIN BEARING BLOOD GROUP A ACTIVITY"<br/><br/>TEXT: <br/>A physicochemical, structural study about a human blood group-A glycoprotein (GP) has been carried out. GP was purified through an affinity column, which contains the lectin Helix pomatia. The main chemical characteristics are: low content of chromophores aminoacids, Jack of cysteine, high content of serine and threonine, and of hexosamines, too.<br/><br/>Owing to the chemical properties of the GP, the Lowry's method valoration is not suitable, and for this reason, it has been developed a new method based on quantifying by light scattering the turbidity that is produced by the addition of absolute ethanol.<br/><br/>The molecular mass of GP is 53500 (determined by light scattering), or 41500 (amino acid analysis), while it presents a 76000 Da dimer form and a 43000 Da monomer form by PAGE-SDS.<br/><br/>The following physicochemical parameters have been determined: absorption in the U.V. spectrum, derivative spectroscopy, variation of spectrum as pH function, ionization of phenolic groups, absorption in the I.R. spectrum, optical rotatory dispersion, viscosity, isoionic and isoelectric points, partial specific volume, solubility and increase of index refraction. Beyond that, the gyration radius, conformation and the action of disturbing agents (urea, dioxane and polyethyleneglycol) have been studied.<br/><br/>Eventually, the structural stability of GP has been determined in front of guanidine hydrochloride, urea and heat. <br/><br/>The results show the GP has a mainly random coil structure, and in this fact, there is a great concordance among the values obtained with O.R.D., viscosity... On the other hand, the molecule is very stable and the denaturalization process is reversible and not involves a mechanism in two steps. </i>