Estudi de la funció de les proteïnes RCAN en l'activació limfocitària: Aplicació en la cerca de nous fàrmacs immunosupressors

Abstract

Calcineurina (Cn), l'única serina treonina fosfatasa dependent de Ca2+ i calmodulina identificada fins al moment, és un enzim clau en la regulació de diverses vies de senyalització cel·lular, entre elles, l'activació limfocitària. Actualment, els protocols d'immunosupressió inclouen l'ús de fàrmacs anticalcineurínics, CsA i FK506, però la seva administració continuada comporta l'aparició de greus efectes secundaris. En els darrers anys s'han descrit diversos inhibidors endògens de Cn, entre ells la família de les calcipressines o regulators of calcineurin (RCAN), que en humans consta de tres membres RCAN1, RCAN2 i RCAN3. Fins al moment de realitzar aquest treball s'havia descrit que RCAN1 interacciona i inhibeix l'activitat fosfatasa de Cn respecte la família de factors de transcripció NFAT a diversos teixits, però no s'havia estudiat a limfòcits T humans. Per això, es va analitzar la interacció de les proteïnes RCAN1 i RCAN3 amb Cn a limfòcits T, així com avaluar el potencial immunosupressor de dites interaccions respecte a la via de senyalització Cn-NFAT.<br/>Els resultats obtinguts han mostrat que els transcrits RCAN1-1 i RCAN3-1,2,3,4,5 s'expressen a nivell basal en línies cel·lulars de limfòcits T humans, Jurkat i Hut78, mentre que el transcrit RCAN1-4, no. A més, l'expressió gènica de RCAN1-4 depén d'un senyal de Ca2+-Cn, mentre que l'expressió dels altres dos transcrits analitzats, no. Mitjançant experiments de co-immunoprecipitació s'ha demostrat que en cèl·lules Jurkat, la interacció RCAN1-1-Cn te lloc de manera endògena i mitjançant assaigs de pull down s'han identificat els dos motius de RCAN1-1 implicats, el motiu CIC i el motiu PxIxxT. En el cas de RCAN3-2, s'ha descrit per primer cop que aquesta proteïna sobreexpressada interacciona amb Cn i que ho fa únicament a través del seu corresponent motiu CIC. Assaigs funcionals in vivo han mostrat que únicament el motiu CIC de les RCAN és el responsable directe de la inhibició de la via de senyalització Cn-NFAT. Com a conseqüència, en cèl·lules Jurkat, s'ha demostrat el potencial immunosupressor del motiu CIC de les RCAN respecte l'expressió gènica de diverses citoquines dependents de NFAT. L'acotament del motiu CIC de les RCAN ha permès identificar una seqüència de 21 aminoàcids, a la qual s'ha anomenat C18, i que correspon a la regió mínima de les RCAN capaç d'inhibir la via de senyalització Cn-NFAT. <br/>Les interaccions C18-RCAN1-Cn i C18-RCAN3-Cn han estat posades a punt i caracteritzades in vitro mitjançant anisotropia de fluorescència. A més, s'ha demostrat que les proteïnes RCAN i NFAT s'interfereixen en la seva interacció amb Cn i que probablement les interaccions C18-RCAN1-Cn i C18-RCAN3-Cn no impliquen la participació directa del centre actiu de Cn. En conjunt, aquests resultats suggereixen que l'efecte immunosupressor de les RCAN seria més específic que el que promouen els fàrmacs inhibidors de Cn, CsA i FK506, utilitzats actualment. Amb la finalitat d'identificar noves molècules amb potencial immunosupressor es van realitzar diversos cribratges utilitzant quimioteques combinatòries que disruptin la interacció C18-RCAN1-Cn. A partir d'aquests experiments s'han identificat quatre hexapèptids i un producte denominat IDI3A que desplacen de manera dosi-dependent la interacció analitzada. L'avaluació funcional del producte IDI3A ha demostrat que aquest inhibeix in vivo la via de senyalització Cn-NFAT i que per tant, te cert efecte immunosupressor. Aquestes dades indiquen que, tant els pèptids C18 de les RCAN com l'assaig in vitro que s'ha dissenyat, constitueixen dues noves eines útils en la cerca de molècules amb potencial immunosupressor.

<i>Calcineurin (Cn), a calcium and calmodulin dependent serine-threonine protein phosphatase, is a key enzyme involved in many cellular processes, including T cell activation. Activated Cn dephosphorylates many substrates, among them the nuclear factor of activated T cells (NFAT) transcription factors, inducing their translocation to the nucleus. There, NFAT are key components of the cytokine gene expression stimulation that triggers T cell activation. Current immunosuppressive protocols include the administration of CsA and FK506, but their continuous use has been correlated with severe side effects. Recently, several Cn endogenous inhibitors have been described, including the protein family of Cn regulators (RCAN, previously known as calcipressins or DSCR1). In the present study it has been characterized the RCAN1 and RCAN3 interaction with Cn in human T lymphocytes. Moreover, it has been evaluated the functional consequence of these interactions towards the Cn-NFAT signalling pathway in vivo.<br/>It has been shown that RCAN1-1 interacts endogenously with Cn in T cells and such interaction takes place through two independent RCAN1-1 sequences, the CIC and the PxIxxT motifs. Moreover, it has been described for the first time that RCAN3-2 binds to Cn and this interaction occurs only through the RCAN3-2 CIC motif. In vivo functional assays have shown that the RCAN CIC motif is the unique direct responsible for the inhibition of the Cn-NFAT signalling pathway. In human T cells, the RCAN CIC motif inhibits NFAT-dependent cytokine gene expression confirming its immunosuppressive effect. <br/>Moreover, it has been identified the minimal RCAN-derived sequence spanning 21 amino acids, which is part of the RCAN CIC motif, that retains the ability of inhibiting the Cn-NFAT signaling in vivo. Peptides spanning this sequence from RCAN1 and RCAN3, have allowed to study the binding mechanism of RCAN proteins to Cn. In vitro, these RCAN-derived peptides bind to Cn with high affinity and selectively inhibit the interaction of Cn with NFAT. Indeed, by screening chemical and peptide libraries, four hexapeptides and a product called IDI3A that modulates the RCAN-Cn interaction in vitro have been identified. In addition, it has also been demonstrated that the IDI3A product inhibits the Cn-NFAT signaling pathway in vivo.</I>