Control de la miogènesi en peixos: Funcions de la miosina, l'IGF-II i els factors reguladors miogènics

Abstract

El treball consta de 4 capítols diferents, dos dels quals ja han estat publicats en revistes científiques.<br/><br/>El primer treball se centra en el paper d'una proteïna estructural del múscul, la cadena pesada de la miosina, en l'ensemblatge de les miofibril.les musculars. L'espècie escollida per l'estudi, el peix zebra, ofereix avantatges importants sobre altres ja que el seu desenvolupament és àmpliament conegut i existeix suficient informació genètica, amb eines moleculars ben dissenyades. Els resultats obtinguts indiquen un paper essencial de la cadena pesada de la miosina tipus 1 especìfica de mùscul vermell, ja que el seu knockdown implica l'alteració dels filaments gruixuts de miosina i prims d'actina del sarcòmer. Pel contrari, les línies M i els discs Z no resulten afectats, confirmant que aquestes estructures són determinades amb anterioritat a l'ensemblatge de l'actina i la miosina.<br/><br/>En el segon capítol, s'examina el paper de l'IGF-II durant el procés de miogènesi en truita irisada, d'especial interès ja que les funcions de l'IGF-II en peixos teleostis difereix de la seva funció en mamífers. Per aquest estudi s'ha utilitzat el model de cultiu primari de cèl.lules musculars i s'ha analitzat el rol de l'IGF-II en processos com la proliferació cel.lular, captació de glucosa i activació de les principals vies de senyalització en múscul. Els resultats presentats indiquen que l'IGF-II poseeix efectes tant mitogènics com metabòlics en cèl.lules musculars de truita irisada i que aquests efectes són equivalents als trobats en resposta a l'IGF-I. Ambdós IGFs realitzen aquests efectes a través de les mateixes vies de senyalització intracel.lulars (MAPK i PI3K/Akt).<br/><br/>El tercer treball està dedicat a la clonació i caracterizació d'un gen clau en el procés de miogènesi en orada, una espècie d'importància cabdal per l'aqüicultura del Mediterrani. En aquest capítol s'ha aïllat les seqüències del gen i del promotor de la miogenina, i s'han caracteritzat elements funcionals. A la vegada, s'ha determinat la seva expressió tissular i en embrions. S'ha vist que la seqüència de la miogenina d'orada comparteix elements reguladors amb les miogenines d'altres espècies, destacant el domini bHLH important per la dimerització de la molècula. El cDNA de miogenina és present tant en múscul blanc com en múscul vermell, i també en cèl.lules en desenvolupament. En embrions, la seva expressió segueix un patró anterio-posterior a mesura que les somites es van formant. L'anàlisi del promotor va revelar que els llocs d'unió a MEF2 i MEF3 són essencials per la seva especificitat muscular.<br/><br/>El quart i darrer capítol intenta correlacionar l'expressió de diferents factors miogènics amb l'IGF-II. Aquesta expressió es va analitzar durant el procés de proliferació i diferenciació de les cèl.lules musculars en cultiu, així com en embrions en desenvolupament, mitjançant tècniques de PCR quantitativa i tècniques alternatives quan fou possible. En els embrions, el trànscrit de miogenina no es va detectar fins el començament de la miogènesi, i la màxima expressió es va trobar 27hpf. El patró d'expressió d'IGF-II suggereix una major importància durant la fase larvària. En cèl.lules musculars en cultiu, MyoD2 s'expressà principalment en la fase proliferativa, mentre que els nivells de miogenina van experimentar un increment durant la diferenciació. L'expressió d'IGF-II fou màxima en estadis primerencs, suggerint una major implicació en el procés de proliferació cel.lular. Els nivells de miostatina es van mantenir baixos durant tot el procés de diferenciació des de cèl.lules satèl.lit fins a miotubs.

<i>The present work consists of four results chapters, two of which have already been published in peer-reviewed scientific journals. <br/>The first one deals with the role of a structural protein, myosin heavy chain, in the myofibrille assembly. The species chosen for the study offers important advantages over others as its development is very well characterised, an important volume of genetic resources is available as well as specialized molecular tools for developmental studies. <br/>In the second chapter, the role of IGF-II in trout myogenesis is examined. The topic is of special interest since IGF-II functions in teleost deviate from those known in mammals. Trout primary muscle cell cultures is an established experimental tool that ensures controlled experimental conditions for the study of physiological factors. Thus, taking advantage of existing methodology, a multi-faceted study was performed to reveal novel functions of IGF-II in muscle proliferation and differentiation in fish as well as the signal transduction system mediating these functions.<br/>The third chapter focuses on the generation on genomic tools and the study of myogenesis in the gilthead sea bream, an important species for Mediterranean aquaculture that reaches large final sizes. Myogenin is a crucial myogenic factor and the chapter follows all the way from the isolation of the promoter of the gene, characterization of functional elements to its expression in primary cell cultures and embryos. <br/>The fourth chapter brings together molecular players and physiological factors of myogenesis in sea bream in an attempt to correlate the expression of different myogenic factors and IGF-II levels. The expression of all factors was followed during proliferation and differentiation of muscle cell cultures as well as in developing embryos. Real-time RT-PCR methods were developed and a thorough study on the appropriate housekeeping gene to-be-used was conducted. Results were verified with alternative methods where possible. </I>