Anàlisi de l'expressió dels gens ParaHox al páncrees endocrí

Abstract

Els gens que formen el cluster ParaHox són factors de transcripció, que a l'origen dels metazous s'originaren per duplicacions d'un gen ancestral comú amb homeodomini. A l'origen dels vertebrat i per duplicacions cromosòmiques o del genoma sencer, aquest cluster es duplicà formant fins a quatre clusters. En el genoma humà trobem un cluster sencer format pels gens <i>Cdx2/3</i>, <i>Pdx1</i> i <i>Gsh1</i> en el cromosoma 13 humà. El gen <i>Gsh2</i> es troba en el cromosoma 4. <i>Cdx4</i> en el cromosoma X i <i>Cdx1</i> en el cromosoma 5. La hipòtesi de treball a l'inici d'aquesta recerca (abans de la seqüenciació del genoma humà) era que existien, molt probablement, d'un a tres gens paràlegs a <i>Pdx1</i> en el genoma humà, que no havien estat identificats. Les estratègies utilitzades basades en la cerca per homologia de seqüència entre els gens duplicats, portà a l'aillament repetides vegades de <i>Pdx1</i>. Finalment la publicació del genoma humà confirmà la no existència de gens <i>Pdx1</i> duplicats identificables en el genoma humà.<br/> Ja que la majoria d'estudis fets sobre l'expressió dels gens ParaHox s'havien realitzat en embrions, es va decidir analitzar l'expressió dels gens ParaHox en diversos teixits adults de ratolí. Això va permetre descriure l'expressió de <i>Pdx1</i> en testicle; <i>Cdx1</i> s'expressa a pulmó i muscle i a nivells baixos a cervell; <i>Cdx2/3</i> a testicle, fetge, pulmó, muscle i també, a nivells baixos a cervell; <i>Cdx4</i> s'expresa en tots els teixits adults analitzats menys en muscle; finalment tan <i>Gsh1</i> com <i>Gsh2</i> s'expressen a testicle i a cervell. <br/>Per tal de veure si els gens ParaHox podien estar implicats en la regulació de l'homeostasi de la glucosa de l'organisme adult, es va analitzar la seva expressió en el pàncrees del ratolí adult, utilitzant les tècniques de hibridació in situ, i es va confirmar la seva expressió en el pàncrees endocrí. Per analitzar en quin tipus cel.lular dels illots s'expressava es va realitzar una doble immunodeteció amb els anticossos anti-insulina i anti-glucagó i es va confirmar l'expressió en cèl.lula "alfa" de tots els gens ParaHox. El gen <i>Pdx1</i> a més d'expressar-se en les cèl.lules "beta" tal com ha estat ampliament descrit, s'expressa en cèl.lules de la perifèria positives pel glucagó, i en algunes cèl.lules aquest marcatge queda retingut a nucli proposant un procés de regulació postranscripcional o pretraduccional. <br/>Finalment per tal d'analitzar l'acció que els gens ParaHox podien tenir sobre la regulació del promotor del gen de la insulina, es van realitzar construccions de tots els gens ParaHox en vectors d'expressió i es van cotransfectar -en cultius de cèl.lules alfa-TC1 i beta-TC6- juntament amb el promotor del gen de la insulina que dirigia l'expressió del gen reporter de la luciferasa. Les transfeccions es realitzaren a dues concentracions diferents de glucosa (0'5 mM i 25 mM) i a diferents concentracions de factors de transcripció. En les cèl.lules beta-TC6, CDX1 és capaç d'activar aquest promotor a elevades concentracions, independentment de la concentració de glucosa. CDX2/3, a elevades dosis transactiva el promotor en presència de glucosa, mentre que CDX4 provoca una forta inhibició depenent de dosi. Ni CDX2/3, ni CDX4 afecten la transactivació del promotor a baixes concentracions de glucosa. En les cèl.lules alfa-TC1, CDX1, a elevades concentracions, transactiva moderadament el promotor en presència de glucosa, i no té cap efecte aparent en absència. CDX2/3 té un efecte inhibidor en absència de glucosa i cap efecte aparent en presència de glucosa. L'efecte més rellevant és l'observat amb CDX4 que, en presència de glucosa, provoca una forta activació del promotor del gen la insulina, més evident a baixes concentracions de factor de transcripció.

ParaHox genes, homeobox transcription factors, are expressed at different stages during mouse development and in different adult tissues. In the adult mouse pancreas, all ParaHox genes are expressed in &#61537; cells, the only exception being <i>Pdx1</i>, that is expressed in beta-cells. In some cells, localised at the periphery of the islets, <i>Pdx1</i> mRNA is retained at the nucleus and does not always colocalise with PDX1 protein, suggesting a postranscriptional regulatory mechanism. In some cells, PDX1 colocalise with glucagon staining.<br/> We transfected all ParaHox genes with the insulin promoter in alpha-TC1 and beta-TC6 cultured cells and we show that they can act as activators or repressors on the insulin promoter. The most interesting result is observed with the transfection of CDX4, where we observe a strong inhibition at high glucose concentration, whereas the opposite result is observed when we transfected CDX4 at high glucose concentration in alpha-TC1 cultured cells. We proppose that ParaHox genes expressed in adult pancreas may be involved in glucose homeostasis regulation, hence they may be good candidates to be involved in diabetes.