Aïllament i caracterització funcional dels elements

Abstract

S'han identificat alguns dels presumptes components de la xarxa gènica implicada en la regeneració dels ulls a planària:<br/><br/>S'ha aïllat un fragment del gen de la opsina; <i>Gtops</i>. Aquest gen s'expressa als cossos neuronals de les cèl·lules fotoreceptores diferenciades.<br/><br/>S'han identificat 2 gens de la família Six/sineoculis a planària: <i>Gtsix1</i> i <i>Gtsix3</i>. <br/><br/>El gen <i>Gtsix1</i>s'expressa com un únic transcrit als cossos neuronals de les cèl·lules fotoreceptores dels ulls adults de planària. Aquest gen és necessari per al manteniment de l'estat diferenciat de les cèl·lules fotoreceptores. La inhibició d'aquest gen amb la tècnica d'RNAi causa la pèrdua del fototropisme negatiu característic d'aquests organismes i també s'ha comprovat la pèrdua gradual de l'expressió de <i>Gtops</i>en els organismes injectats amb dsRNA de <i>Gtsix1</i>que genera un fenotip cec. Suggerim un efecte inhibidor indirecte de <i>Gtsix1</i> sobre <i>Gtops</i>. <br/><br/>Durant el procés de regeneració anterior, el gen <i>Gtsix1</i> s'expressa als 3 dies de regeneració en un grup de cèl·lules pròximes a l'epidermis dorsal. En aquest estadi es determinaria el territori presumptiu dels ulls, i aquestes cèl·lules serien el primer signe visible del procés de diferenciació de les cèl·lules que formaran els ulls.<br/><br/>El gen <i>Gtsix1</i> té un paper clau en la determinació primerenca dels ulls a planàries. Els estudis de pèrdua de funció amb RNAi mostren una inhibició completa de la regeneració dels ulls. Aquests resultats estan d'acord amb un paper ancestral dels gens del grup <i>Six1-2 </i>en la morfogènesi de l'ull a Protóstoms.<br/><br/>El gen <i>Gtsix3</i>, per altra banda, s'expressa en una franja de cèl·lules envoltant els ganglis cefàlics que correspondria a la part distal de les branques del cervell que connecten els ganglis cefàlics amb els diferents sensors distribuïts al llarg dels marges del cap.<br/><br/>Durant el procés de regeneració anterior, l'expressió de <i>Gtsix3</i> es localitza en el blastema, a ambdós costats de la zona de regeneració dels nous ganglis cefàlics. Aquesta expressió s'extén entre els 6-10 dies de regeneració fins a adquirir el patró d'expressió trobat en els organismes adults.<br/><br/>S'ha identificat un nou gen <i>Pax6</i> a planàries: <i>Gtpax6A</i>. El genoma de les planàries <i>G. Tigrina</i> i <i>D. Japonica</i> presenta, així, dos gens <i>Pax6</i> (<i>Gtpax6A/Djpax6A</i> i <i>Gtpax6B/Djpax6B</i>).<br/><br/>El gen <i>Gtpax6A</i> és més similar estructuralment a altres gens <i>Pax6</i> que el gen <i>Gtpax6B</i>, i és aquest últim el gen <i>Pax6</i> més divergent descrit fins al moment.<br/><br/>Els dos gens <i>Pax6</i> de planàries s'haurien generat per una duplicació en un tríclad o plathielmint ancestral ja que no presenten cap ortologia clara amb els gens <i>ey</i> i <i>toy</i> de <i>Drosophila</i>.<br/><br/><i>Gtpax6A</i> i <i>Gtpax6B</i> s'expressen al Sistema Nerviós Central de les planàries adultes, marcant els ganglis cefàlics i els cordons nerviosos. <i>Gtpax6B</i> presenta, però, uns nivells d'expressió més baixos.<br/><br/>S'ha detectat mRNA dels gens <i>Gtpax6A</i> i <i>Gtpax6B</i> tant a les cèl·lules fotoreceptores com a les cèl·lules pigmentàries dels ulls de planàries per <i>in situ</i> analitzades en TEM.<br/><br/>Suggerim un paper important dels gens <i>Pax6</i> de planàries en la formació de les estructures neurals. Durant el procés de regeneració, l'expressió d'ambdós gens Pax6 s'activa ràpidament en forma de dues taques intenses a la zona d'amputació dels cordons nerviosos antics. A mesura que avança el procés de regeneració el senyal d'expressió de <i>Gtpax6A</i> ens ha permès fer un seguiment del procés de regeneració dels ganglis cefàlics. Al final del procés de regeneració l'expressió de <i>Gtpax6A</i> torna als seus nivells basals. <br/><br/>La inactivació dels gens <i>Gtpax6A</i>, <i>Gtpax6B</i> i una combinació d'ambdós gens mitjançant la tècnica d'RNAi a les dues espècies estudiades no provoca la inhibició de la regeneració dels ulls. Tampoc s'inhibeix o es modifica el patró d'expressió dels gens <i>Gtsix1</i> i <i>Gtops</i>, ni hem pogut detectar cap alteració en el sistema nerviós central amb aquesta tècnica. <br/><br/>Hem comprovat que la tècnica d'RNAi provoca un forta reducció dels nivells de mRNA dels gens <i>Pax6</i> de planària, però no la inhibició completa i es podria hipotetitzar un mecanisme dosi-independent de l'activitat dels gens <i>Pax6</i> a planàries.<br/><br/>Els gens <i>Gtpax6A/Djpax6A</i> i <i>Gtpax6B/Djpax6B</i> no serien components essencials en la xarxa gènica que controla la determinació i diferenciació dels ulls de planàries durant el procés de regeneració. Suggerim que altres gens poden compensar o substituir l'activitat d'aquests durant el procés de regeneració dels ulls a planàries.

<i>Isolation and functional characterization of elements <I>Pax6</I> and sineoculis as components of the genetic pathway involved in planarian eye regeneration.</i></br></br> We have identified some of the components of the genetic pathway involved in planarian eye regeneration:<br/><br/>We have identified a peace of the opsin gene; <I>Gtops</I>. This gene is expressed in the neuronal bodies of the photoreceptor cells.<br/><br/>We have identified two genes of the <I>Six/sineoculis</I> family in planaria: <I>Gtsix1</I> and <I>Gtsix3</I>. <br/><br/><I>Gtsix1</I> gene is also expressed in the neuronal bodies of the photoreceptor cells. This gene is essential for the maintenance of the differentiated state of fotoreceptor cells and for eye regeneration. <br/><br/><I> Gtsix3</I> expression in the adult planarian head is located in a stripe surrounding the cephalic ganglia, from the auricles to the tip of the head. This localization corresponds to the distal part of the brain branches that connect the cephalic ganglia to the distinct sensors distributed along the head margin. <br/><br/>We also report the presence of two <I>Pax6</I>-related genes; <I>Pax6A</I> and <I>Pax6B</I>, wich are highly conserved in two planarian species <I>Dugesia japonica</I> and <I>Girardia tigrina</I>. Pax6A is more similar to other Pax6 proteins than Pax6B, which is the most divergent Pax6 described so far. The planaria <I>Pax6</I> homologs do not show any clear orthology to the <I>Drosophila</I> duplicated genes, <I>eyeless</I> and <I>twin of eyeless</I>, which suggest an independent <I>Pax6</I> duplication in a triclad or platyhelminth ancestor. <I>Pax6A</I> is expressed in the central nervous system of intact planarians, labeling a subset of cells of both cephalic ganglia and nerve cords, and is activated during cephalic regeneration. <I>Pax6B</I> follow a similar pattern, but shows a lower level of expression. <I>Pax6A</I> and <I>Pax6B</I> transcripts are detected in visual cells only at ultrastructural level, probably because a limited amount of transcripts is present in these cells. Inactivation of both <I>Pax6A</I> and <I>Pax6B</I> by RNA-mediated gene interference inhibits neither eye regeneration nor eye maintenance, suggesting that the genetic network that controls this process is not triggered by <I>Pax6</I> in planarians.