Estudio de heparinas y heparinoide de bajo peso molecular, pentasacárido y heparina no fraccionada en un modelo de trombosis

Abstract

La heparina es una familia de cadenas de glicosaminoglicanos (GAGs) formados por residuos de glucosamina y ácido urónico, cuya eficacia y seguridad en la profilaxis y tratamiento de las enfermedades trombóticas están bien establecidas.<br/><br/>El descubrimiento de que parecía posible desdoblar el efecto inhibidor del factor Xa de la inhibición de la trombina, con las fracciones de bajo peso molecular de la heparina despertó grandes expectativas y condujo a la introducción en terapéutica de las heparinas y heparinoides de bajo peso molecular. Debido a los distintos procedimientos de obtención y a las diferentes unidades utilizadas por los fabricantes para expresar la actividad de sus productos, las comparaciones entre los distintos preparados eran complicadas.<br/><br/>Esta situación indujo a la realización de la presente tesis en la que se comparó el efecto de distintos GAGs sobre la hemostasia en un modelo de trombosis in vitro.<br/><br/>Los productos estudiados fueron: Fragmin® (Kabi) y Fraxiparinc® (Sanofi), dos heparinas de bajo peso molecular que se obtienen a partir de la heparina por despolimerización y purificación; Lomoparán® (Organon) un hiparinoide de bajo peso molecular que se produce directamente de mucosa intestinal porcina; Org 31550 es un derivado sintético del pentasacárido natural de unión a la ATIII y está exento de toda acción inhibidora de la trombina; la heparina no fraccionada estudiada (HNF, Laboratorios Rovi) es la disponible comercialmente y se obtiene de mucosa intestinal porcina.<br/><br/>Debido a las distintas unidades empleadas por los fabricantes, en primer lugar hubo que seleccionar la concentración óptima que sería utilizada en las perfusiones, para cada uno de los productos. De forma arbitraria se decidió utilizar la mínima necesaria que inhibiera la formación de trombina en sangre mantenida en reposo a temperatura ambiente. Como indicador de la formación de trombina se determinó la concentración de fibrinopéptido A (FPA).<br/><br/>A continuación se estudió el efecto de los GAGs sobre el funcionalismo plaquetario a las dosis seleccionadas. Para ello se realizaron perfusiones en las que se cuantificó el depósito de plaquetas sobre la superficie expuesta al flujo y se evaluó la formación de microagregados plaquetarios.<br/><br/>Las perfusiones se realizaron en una cámara de perfusión desarrollada por Sakariassen. La superficie adhesiva era matriz extracelular (MEC) de células endoteliales (CE) cultivadas in vitro. Expuesta al flujo esta matriz induce la adhesión plaquetaria, pero no la formación de trombos. Para obtener una matriz trombogénica que permitiera estudiar la formación de fibrina y trombos plaquetarios, las células fueron estimuladas con un éster de forbol que induce en las CE la síntesis y depósito de factor tisular en la MEC que activará la cascada de la coagulación que conducirá a la producción de trombina.<br/><br/>En la evaluación en face de la adhesión plaquetaria se cuantificó la superficie cubierta (SC) por plaquetas. Los trombos plaquetarios se evaluaron en sección transversal que permite cuantificar la superficie cubierta por trombos de diferentes alturas. Al finalizar las perfusiones se midió la formación de microagregados (SPD) realizando recuentos en EDTA y en glutaraldehído en un contador automático fijando la ventana de recuento entre 3,2 y 16 fl. La idea es que los microagregados formados durante la perfusión se deshacen al colocarlos en una EDTA, y por el contrario son fijados en glutaraldehído y no son valorados por el contador.<br/><br/>El siguiente paso consistió en encontrar un método fiable que permitiera cuantificar la fibrina depositada sobre la matriz. En primer lugar se comparó la técnica que se pensaba utilizar, que es la del Fg-PO con la del Fg marcado con iodo 125 que se considera el patrón pero que tiene el inconveniente de que obliga a trabajar con material radioactivo. Para el estudio comparativo se realizaron perfusiones sobre matriz trombogénica en las que la fibrina se midió con las dos técnicas a la vez.<br/><br/>Una vez establecida la técnica a utilizar se estudió el efecto de los glicosaminoglicanos y de las condiciones de flujo sobre la formación de fibrina, utilizando las mismas condiciones de perfusiones que antes.<br/><br/>RESULTADOS<br/><br/>Se observa que Fragmin y Fraxiparine son casi igualmente efectivas inhibiendo la formación de trombina en la sangre en reposo en términos de molaridad (33,2 Y 36,8 nmol/ml aunque difieren considerablemente cuando se expresan en las U del fabricante (20 y 40 U/mi). Mucha mayor cantidad se requiere de Lomoparan (146,4 nmol/ml) y del pentasacárido 31550 (95,2 nmol/ml) posiblemente debido a su menor actividad inhibidora de la trombina. Como cabía esperar por su actividad anti-trombina mucha menor cantidad de HNF fue necesaria (1,9 nmol/ml).<br/><br/>Con la sangre anticoagulada con Lomoparan, la SC por plaquetas es significativamente mayor a los otros GAGs. Respecto al SPD la cifra de Lomoparan es menor aunque sólo es estadísticamente significativa comparada con la obtenida con Fragmin. Al estudiar la relación entre SC y SPD en cada una de las perfusiones realizadas, se observa que presentan una correlación lineal inversa estadísticamente significativa. Parece probable que la mayor SC observada con Lomoparan sea debido a su menor capacidad de formación de microagregados.<br/><br/>Cuando se estudió el efecto sobre la formación de agregados, sólo en la superficie cubierta por agregados mayores de 10 milimicras se observaron diferencias, siendo menor para heparina no fraccionada y Lomoparan que para Fragmin y Fraxiparine. Sabemos que la formación de trombos plaquetarios en estas condiciones es un proceso trombina dependiente. Por lo tanto las diferencias observadas en los agregados de mayor tamaño posiblemente sea debida a diferencias en la cantidad de trombina formada. Presentando la HNF la mayor capacidad de inhibición, y tras ella Lomoparan, Fragmin y Fraxiparine.<br/><br/>Tras realizar los estudios comparativos se decidió utilizar el marcaje con yodo pues a pesar de que la manipulación del material radioactivo es más engorrosa, proporciona unos resultados fiables.<br/><br/>Una vez seleccionada la técnica a utilizar, se estudió el efecto de los glicosaminoglicanos y del flujo sobre el depósito de fibrina.<br/>La cantidad de fibrina depositada en las perfusiones realizadas con sangre anticoagulada con la HNF, a ambos coeficientes de cizalladura es casi inexistente. Ni la microscopía óptica ni la electrónica, mostraron fibrina en absoluto; estas cifras probablemente muestran los valores de fondo correspondientes al Fg-Yodo asociado a la MEC y/o a las plaquetas.<br/><br/>Por el contrario, la fibrina formada con los otros GAGs varió considerablemente dependiendo del tipo de anticoagulante y el coeficiente de cizalladura. A 300 s(-1) el pentasacárido Org 31550 proporcionó las cantidades mayores de fibrina formada, seguido por Fraxiparine y Fragmin. Lomoparan inhibió el depósito de fibrina en mayor proporción.<br/><br/>Cuando el coeficiente de cizalladura se aumentó a 1.300 s(-1) la cantidad de fibrina disminuyó. Para el pentasacárido y la HNF, la reducción no alcanzó significación estadística. Sí lo fue para Fraxiparine, Fragmin y Lomoparán, en los que rondó alrededor del 80%.<br/><br/>La generación del FPA siguió el mismo patrón que la fibrina, es decir el menor aument o correspondió a la HNF, ya continuación Lornoparan, Fragmin y Fraxiparine y el mayor al pentasacárido. El aumento en los niveles de fibrinopéptido A se detuvo al fmalizar la perfusión en todos los GAGs excepto para el pentasacárido. En este caso, a los 15' de acabar la perfusión los niveles de FPA habían crecido aproximadamente un 30%. Esto probablemente indica que una vez se ha formado trombina escapa a los mecanismos de inhibición y continua ejerciendo su acción en la fase líquida.<br/><br/>Entre los GAGs de bajo peso molecular Lomoparán posee un efecto antitrombina mayor que Fragmin y Fraxiparine. Este mayor potencial antitrombólico podría deberse a la presencia de dermatán sulfato, pues recientemente se ha demostrado que los complejos de dermatán sulfato-cofactor JI de la heparina son capaces de inhibir a la trombina unida a la fibrina mientras que los complejos de antitrombina III-heparina no lo son. El perfil de acción de Fragmin y Fraxiparine es más o menos igual con una tendencia de Fraxiparine hacia un menor efecto antitrombótico.<br/><br/>Las diferencias observadas en la generación de FPA comparando los dos coeficientes de cizalladura no fueron estadísticamente significativas. Esto sugiere que la menor cantidad de fibrina depositada a alto coeficiente de cizalladura posiblemente se debe a una menor polimerización de los monómeros de fibrina inducida por el flujo que a un defecto en la formación de trombina.

<i>Low molecular weight heparin(oid)s (LMWH) differ markedly in terms of molecular composition and activity. In order lo gel more insight into the effect on platelets and fibrin deposition we have compared Fragmin® (KabiVitrum, FA), Fraxiparine® (Choay Laboratories, FP), Lornoparan®, a LMW heparinoid (Organon, LO), a synthetic derivative of rhe natural pentasaccharide, Organon 31550 (PE) and unfractionated heparin (Rovi Laboratories, UH) in a perfusion systern. The concentration selected for perfusion studies was the lowest which inhibited thrombin generation (measured as increase in fibrinopeptide A, FPA) in blood stored for 3 hours at room temperature. Blood from healthy donors was anticoagulated with FA 20 U/ml, FP 40 U/ml, LO 15 U/ml, PE 200 U/ml and UH 5 U/ml. Perfusions were carried out in a rectangular chamber at a shear rate of 300 and 1300 s(-1) for 5 minutes. The extracellular matrices (ECM) used as adhesive surface were obtained from cultured human umbilical vein endothelial cells. A part of these cells were stimulated with phorbol myristate acetate for 16 hours to induce tissue factor synthesis and thrombin formation in the ECM.<br/><br/>The extent of platelet aggregation during perfusion was measured as single platelet disappearance (SPD) by comparing platelet counts in EDTA and glutaraldehyde. Fibrin deposition was measured with IUI-fibrinogen. FPA generation during perfusion was assessed with a RIA kit. In the perfusions performed al 1300 s(-1)' for 5 min, over non stimulated ECM, LO showed a significantly higher platelet adhesion than the other heparins. This correlated with a significantly lower SPD during perfusion. In perfusions carried out at 300 s(-1) over stimulated ECM, all LMWH's and PE gave significantly more fibrin deposition than UH. LO gave less fibrin than the others LMWH's. When the shear rate was increased to 1,300 s(-1) the amount of fibrin deposited on !he ECM decreased, with no changes in the amount of FPA generated, indicating that probably it was due to a defect on fibrin polymerisation more than to a impairment of thrombin formation. In conclusion: in this experimental model, LO exerts less effect on platelets than the other heparins studied. All LMWH's tested and PE, but not UH, a1low local thrombin generation and fibrin deposition on subendothelium. LO inhibited fibrin deposition to a larger extent than the other LMWH's. </i>