Efecte de l'estrès oxidatiu en taupaties

Abstract

La present tesi s'ha centrat en l'estudi de l'efecte de l'estrès oxidatiu proteic en les malalties neurodegeneratives, concretament en el grup de les taupaties.<br/><br/>El fenomen de l'estrès oxidatiu s'ha vist implicat en les malalties neurodegeneratives afectant als glúcids, als lípids, als àcids nucleics i a les proteïnes, representant aquestes últimes entre un 50-75% de les dianes d'oxidació dels radicals lliures. El fet de treballar amb teixit cerebral humà representa un gran avantatge doncs s'està analitzant directament el substrat real on s'ha desenvolupat la malaltia però s'han de tenir en compte diversos factors post mortem que poden interferir en la preservació del teixit, on el temps de retardament post mortem és un d'ells. Els resultats obtinguts, en mostres d'escorça frontal sotmeses a un retardament post mortem artificial a temperatura ambient, van permetre concloure que les modificacions d'oxidació i de nitració de les proteïnes es mantenen estables fins a les 8h post mortem observant-se modificacions a partir de les 20h. A partir d'aquí es va passar a esbrinar quines eren les dianes d'oxidació proteïques en l'escorça frontal de determinades taupaties utilitzant, principalment, tècniques de gels bidimensionals i western blot. En mostres de paràlisi supranuclear progressiva (PSP) es va observar un augment de l'adducte de lipoxidació 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) en les proteïnes, comparant amb els casos controls. Es van identificar dos enzims: la fosfoglicerat cinasa-1 (FGC-1) i la fructosa difosfat aldolasa A (aldolasa A), ambdós implicats en el procés de la glicòlisi. Pel que fa a les malalties agrupades dins de la degeneració frontotemporal lobar (DFTL), es van estudiar la DFTL amb la mutació P301L (DFTL-tau), la DFTL amb inclusions negatives per la tau però immunoreactives per la ubiqüitina (DFTL-U) i la DFTL associada a l'esclerosi lateral amiotròfica (DFTL-ELA). En tots els casos de DFTL-tau, en 3 dels 10 de DFTL-U i 2 dels 3 de DFTL-ELA es va observar un increment de l'HNE que correlacionava amb la gliosis i on la GFAP es va identificar com la proteïna diana majoritàriament lipoxidada, mostrant que els astròcits són vulnerables a la lesió lipoxidativa. La majoria de proteïnes dianes, que s'han descrit a la bilbiografia, identificades com a modificades nitro/oxidativament van agrupar-se en diferents categories: vies metabòliques (incloses glicòlisi i metabolisme energètic), citoesquelet, xaperones, resposta a l'estrès cel·lular i elements del sistema ubiqüitina-proteosoma sent moltes d'aquestes proteïnes comunes en les diferents malalties neurodegeneratives. El fraccionament cel·lular, la utilització de diferents buffers, la detecció dels residus específics nitro/oxidats, la validació de la disfuncionalitat dels enzims mitjançant estudis d'activitats,... serien una sèrie de factors a tenir en compte en la tècnica dels gels bidimensionals i la posterior identificació de les proteïnes.

<I>"Oxidative stress effect on tauopathies"<br/><br/>TEXT:<br/><br/>The aim of this thesis has been focused on the study of the oxidative stress effect on the proteins in neurodegenerative diseases, specifically on the tauopathies.<br/><br/>The oxidative stress phenomenon has been involved in neurodegenerative diseases affecting to carbohydrates, lipids, nucleic acids and proteins being these last the great majority of oxidation targets.<br/><br/>Brain samples may be modified by post mortem factors, so it's necessary to know how these influence. The effect of post-mortem delay on protein preservation largely depend on the temperature of storage. In our studies frontal cortex samples were subjected to progressive artificial post mortem delay at room temperature and several nitration and oxidation markers were used against proteins. The results showed protein modfications were stable during the first 8h but there were modifications from 20h onwards. Next step was to study which were the protein target of oxidation in frontal cortex in different tauopathies using, mainly, bidimensional gel electrophoresis and western blot. Progressive supranuclear palsy (PSP) samples revealed 4-hydroxi-2-nonenal (HNE) damage increased compared with control cases. Two proteins were identified: phosphoglycerate kinase-1 (PGK-1) and fructose bisphosphate aldolase A (aldolase A), both enzims are involved in glycolysis. <br/>Frontotemporal lobar degeneration (FTLD) designates a group of diseases which we studied FTLD with the P301L mutation in the tau gene (FTLD-tau), FTLD tau-negative ubiquitin-immunoreactive inclusions (FTLD-U) and DFTL associated to amyotrophic lateral sclerosis (DFTL-ALS). Most of the cases of these pathologies revealed an HNE-adducts increased which correlated with astrocytosis and discosed GFAP as a target of lipoxidation. Vulnerable proteins can be mostly grouped in defined metabolic pathways covering glycolysis and energy metabolism, cytoskeletal, chaperoning, cellular stress responses and members of the ubiquitin-proteasome system and most of these proteins are comuns in the different neurodegenerative diseases. Subcellular fraction of the sample, use different protocols and buffer to capture different proteins, detection of specific residues of oxidative modifications, enzymatic activities,..these points may improve the bidimensional gel electrophoresis tecniques and also the protein identification. </I>