The role of cyclin D3 in pancreatic β-cell metabolic fitness and viability in a cell cycle-independent manner. Implications in autoimmune diabetes

Abstract

La diabetis tipus 1 (DM1) és una malaltia autoimmune causada per la destrucció de cèl·lules productores d'insulina β en els illots pancreàtics, aquesta destrucció és mediada per limfòcits. En aquesta tesi es pretén donar a conèixer les dianes moleculars de les cèl·lules β responsables de la mort de les cèl·lules β causada per l'atac limfocític. Es van realitzar assajos de microarrays per tal d’identificar els gens expressats diferencialment en les cèl·lules endocrines d’illots, com a conseqüència de la infiltració insulítica, mitjançant la comparació de cèl·lules endocrines d’ illots provinents de ratolins NOD (Non Obese Diabetic)- model de ratolí predisposat genèticament a la diabetis autoimmune-, amb les provinents del seu homòleg lliure de limfòcits, NOD / SCID. Curiosament, vam descobrir que la ciclina D3 (CcnD3) es regula a la baixa a conseqüència de la inflamació d'una manera dosi-dependent, mentre que l'activitat proliferativa de les cèl·lules β no es veu alterada per aquesta disminució en l’expressió de ciclina D3. A més, les cèl·lules NIT-1 que sobreexpressen Ciclina D3 resten protegides de l'apoptosi espontània i de l'apoptosi induïda per un entorn proinflamatori proporcionat per IL-β. Per demostrar la relació de causalitat entre la repressió de CcnD3 repressió i la mort de les cèl·lules β in vivo, hem estudiat l’aparició de diabetis espontània en ratolins NOD deficients en CcnD3 (NODCcnD3KO). Els ratolins NODCcnD3KO desenvolupen diabetis exacerbada en comparació amb companys de llodrigada de tipus salvatge (WT) (88% enfront de 61% respectivament), i aquest fet deu únicament a la deficiència de CcnD3 a les cèl·lules β i no a un augment de diabetogenicitat del repertori limfocític dels ratolins NODCcnD3KO. No obstant això, l'exacerbació de la diabetis requereix de la complicitat de tots dos, la deficiència CcnD3 i la inflamació, ja que els ratolins NOD/SCIDCcnD3KO, els quals no tenen limfòcits, no desenvolupen diabetis espontània. CcnD3 té també un paper essencial en la fisiologia les de cèl·lules β del pàncrees, ja que illots pancreàtics deficients en CcnD3 no experimenten canvis adients en les concentracions intracel·lulars de Ca2+ en resposta a concentracions canviants de glucosa en el medi, el qual denota una sensibilitat deficient a la glucosa en aquests illots. Aquest deteriorament d'acoblament concentració de glucosa en el medi extracel·lular i l’augment a la concentració intracel·lular de Ca2+ no és a causa dels canvis en els nivells d’expressió del transportador de glucosa GLUT-2 entre illots NODCcnD3 KO i NODWT. D'altra banda, hem desenvolupat ratolins transgènics que sobreexpressen ciclina D3 en cèl·lules β pancreàtiques (NOD/RIPCcnD3). Aquests ratolins mostren protecció contra la diabetis autoimmune i rescaten ratolins NOD CcnD3KO de desenvolupar diabetis exacerbada.

Type 1 Diabetes (T1D) is an autoimmune condition caused by the lymphocytemediated destruction of insulin-producing β cells in pancreatic islets. This thesis aims to unveil the final targets in the β cells responsible for the β cell loss caused by the lymphocytic attack. Microarray studies were performed to assess differentially expressed genes in islet endocrine cells as a consequence of insulitic infiltration by comparing the autoimmune-prone Non-Obese Diabetic (NOD) mouse model with its congenic, lymphocyte-free, NOD/SCID strain. Interestingly, we discovered that cyclin D3 (CcnD3) underwent downregulation in beta cells upon inflammatory insult in a dose-dependent manner, while the proliferative activity of beta cells downregulating CcnD3 was not altered. Moreover, NIT-1 cells stably overexpressing CcnD3 were protected from spontaneous apoptosis and from apoptosis induced by a proinflammatory environment provided by IL-1β. To demonstrate the causal link between CcnD3 repression and β cell death in vivo, we studied spontaneous diabetes onset in CcnD3 deficient NOD mice (NODCcnD3KO). NODCcnD3KO mice developed exacerbated diabetes compared to the wild type (WT) littermates (88% versus 61% respectively), and this fact was solely due to the CcnD3 deficiency in the β cells and not to an increased diabetogenicity of the NODCcnD3KO lymphocytic repertoire. However, diabetes exacerbation required the complicity of both CcnD3 deficiency and inflammation, since plain NOD/SCID CcnD3KO mice did not develop spontaneous diabetes. CcnD3 also plays an essential role in pancreatic β-cell fitness, since pancreatic islets deficient in CcnD3 do not experience proper intracellular Ca2+ influx changes in response to different concentrations of glucose. This impairment, coupling glucose concentration in the extracellular milieu and intracellular increase in Ca2+ concentration, is not due to changes in Glut-2 expression levels between the CcnD3 KO and WT islets. Moreover, we developed transgenic mice overexpressing cyclin D3 in pancreatic β cells (NOD/RIPCcnD3). These mice exhibit protection from autoimmune diabetes and NOD CcnD3KO mice are prevented from developing exacerbated diabetes.

La diabetes tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune causada por la destrucción de las células β productoras de insulina en los islotes pancreáticos por parte de los linfocitos. En esta tesis pretendemos dar a conocer dianas moleculares de las células β responsables de pérdida de la célula β causadas por el ataque linfocitico. Desarrollamos un estudio de microarreglos en el cual encontramos genes expresados diferencialmente en células endócrinas del islote como consecuencia de la infiltración insulítica mediante la comparación de un modelo de ratón autoinmune susceptible No Obeso Diabético (NOD) con una cepa congénica libre de linfocitos NOD/SCID. Interesantemente, descubrimos que, la ciclina D3 (CcnD3) experimentó una disminución como consecuencia de un asalto inflamatorio de forma dosis dependiente, mientras que la actividad de proliferación de las células β no fue alterada. Además, células NIT-1 que sobreexpresan CcnD3 fueron protegidas de apoptosis espontánea y apoptosis inducida por un entorno proinflamatorio proporcionado por la IL-1β. Para demostrar la relación causal entre la represión de la CcnD3 y la muerte de las células β in vivo, hemos estudiado la aparición de la diabetes espontánea en ratones NOD deficientes en CcnD3 (NODCcnD3KO). Los ratones NODCcnD3KO desarrollan una diabetes exacerbada en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) (88% contra el 61% respectivamente) y este hecho debido únicamente a la deficiencia de CcnD3 de las células β y no a un aumento de diabetogenicidad del repertorio linfocítico de los ratones NODCcnD3KO. Sin embargo, la exacerbación de la diabetes requiere la complicidad de ambos, la deficiencia de CcnD3 e inflamación, ya que los ratones NOD/SCIDCcnD3KO, los cuales carecen de linfocitos, no desarrollan diabetes espontánea. CcnD3 tiene también un papel escencial en la fisiología de las células β del páncreas, ya que los islotes deficientes de CcnD3 no experimentan cambios apropiados en las concentraciones intracelulares de Ca2+ en respuesta a diferentes concentraciones de glucosa en el medio. Este deterioro en el acoplamiento de la concentración de glucosa en el medio extracelular y aumento de la concentración intracelular de Ca2 + no es debido al cambio del nivel de expresión del transportador de GLUT-2 entre islotes NODCcnD3 KO y NODWT. Por otro lado, hemos desarrollado ratones transgénicos que sobreexpresan la ciclina D3 en células β pancreáticas (NOD/RIPCcnD3). Estos ratones muestran protección contra la diabetes autoinmune y rescatan a ratones NOD CcnD3KO de desarrollar diabetes exacerbada.