Estudio estructural de proteínas implicadas en el metabolismo del genoma mitocondrial: Helicasa y Factor de Transcripción A Mitocondrial, TFAM

Abstract

La mitocondria es un orgánulo de las células eucariotas en el cual se desarrollan multitud de procesos esenciales para la célula de los cuales se destacan la cadena de transporte de electrones, la síntesis de ATP, el ciclo de Krebs, regulación de la osmosis del calcio, apoptosis, etc. La mitocondria posee su propio genoma (mtADN) y su conservación es esencial para la viabilidad de la mitocondria y por tanto de la célula. El mtADN se transcribe y replica de modo independiente a la división celular y posee su propia maquinaria de replicación y transcripción.

En este trabajo se expone el estudio de dos proteínas implicadas en el metabolismo del mtADN con funciones muy diferentes. La primera es Twinkle, es una helicasa y participa en la replicación del ADN mitocondrial. La segunda es TFAM, es una proteína implicada en múltiples procesos del metabolismo del mtADN, tales como transcripción mediante la interacción en las secuencias LSP y HSP, compactación del genoma mitocondrial, unión de las secuencias Site-X y Site-Y, reconoce estructuras dañadas del ADN, etc.

El estudio de ambas proteínas se desarrolló principalmente en el marco de la biología estructural empleando técnicas como cristalografía de proteínas, microscopía electrónica y dispersión de bajo ángulo de rayos-X (SAXS). Además, los datos de obtenidos con estas técnicas fueron complementados con técnicas bioquímicas como calorimetría de titulación isotérmica (ITC), barrido diferencial de fluorescencia (DSF), ensayos enzimáticos y estudios de interacción proteína-ADN mediante técnicas electroforéticas y dispersión dinámica de la luz (DLS).

El complejo proteína-ADN TFAM/ Site-X fue cristalizado y su estructura tridimensional resuelta. TFAM se compone de dos dominios HMGbox1 y 2 que contactan al ADN por el surco menor y además cada unos de ellos provoca que se doble 90 º el ADN. Además están conectados entre sí por un “linker” que posee una estructura tipo hélice que también interacciona con el surco menor. Finalmente TFAM envuelve al ADN doblado formando una estructura tipo “U-turn”. Los estudios termodinámicos no mostraron diferencias importantes entre distintos complejos TAFM/ADN con respecto a TFAM/Site-X. Todos ellos presentaron en todos los casos el típico perfil endotérmico de asociado a proteínas de unión al surco menor, excepto el complejo TFAM/poli-dA cuyo ADN es rígido y mostró un perfil exotérmico. Mediante estudios de dinámica molecular se evaluó la rigidez del ADN y se realizó una simulación de su estructura en disolución. Estos resultados mostraron que TFAM reconoce un patrón estructural del ADN definido por una región rígida y pre-doblada a 10pb de una región flexible también pre-doblada en las cuales contactan HMGbox1 y 2, respectivamente.

En el segundo proyecto, Twinkle se logró expresar de modo recombinante en E.coli a gran escala de un modo soluble. Se estudió biofísicamente mediante DSF y DLS, y bioquímicamente se estudió su actividad helicasa y su interacción con el ADN.

Además gracias a los estudios por crio-microscopía y SAXS, y con la ayuda de un programa de modelaje por predicción de estructura por homología de secuencia, se realizó un modelo del hexámero por microscopía, del heptámero por SAXS. Además mediante ambas técnicas de observo la gran flexibilidad de la proteína, principalmente del dominio N-terminal que se componer por dos subdominios ZDB y RDP los cuales se unen entre ellos por un “linker” desordenado e además tienen una interacción tipo trans entre los subdominios ZBD y RPD del monómero adyacente. Twinkle tiene otro “linker” flexible entre el RDP el dominio helicasa C-terminal. El domino C-terminal forma una estructura rígida de anillo y es responsable de la oligomerización, tanto para formar hexámeros como heptámero. En disolución Twinkle está en equilibrio entre los dos estados oligoméricos: hexámero y heptámero.

In this thesis are described two projects with two different DNA binding proteins: TWINKLE and TFAM in complex with DNA (Site-X). Both protein are human proteins and are involved into DNA mitochondrial metabolism, Twinkle is involved in mitochondrial DNA replication and TFAM in the DNA transcription and mitochondrial genome packaging.

Crystallographic structure of TFAM/Site-X complex was solved using a molecular replacement method. TFAM is composed by two HMGbox, each one of them bind and bend the DNA Site-X in one point, bending the DNA 90º, and adopting a “U-turn” shape. From a structural point of view, all TFAM/DNA complexes did not show great differences between them. The TFAM/DNA complexes were analyzed by Isothermal Titration calorimetry and showed the same endothermic profile, typical from DNA-binding protein which bend the DNA as a consequence of minor groove interactions, and also similar thermodynamic values. However, TFAM-poly-dA complex showed an exothermic profile. In addition, molecular dynamic technique was used to study the rigidity and simulated the structure of Site-X in an unbounded state. This result showed that TFAM recognize a prebending Site-X DNA, and HMGbox1 bends in a rigid region and HMGbox2 in a flexible region, but both are prebended. This result may suggest this is a general recognition for others DNA sequences.

The second project, consisted on the study of a human mitochondrial helicase: Twinkle. The structural data from this protein was obtained with a low resolution techniques: electron microscopy (EM) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS). Despite the big difference between these two techniques, both showed similar results. With both techniques was seen that Twinkle is in equilibrium between a hexamer and heptamer in solution. Several 3D structure models were generated for both oligomeric states. In these model the C-terminal domain is responsible of oligomerization in a ring shape, even six or seven units for hexamer and heptamer respectively. The N-terminal domain is divided in two subdomains called ZBD and RPD. These domains are responsible of the Twinkle flexibility, both are connected by a disorded linker, and also the subdomains RDP are connected to the ring domain through other disorded linker. This flexibility was observed by EM and SAXS