Identificación, biogénesis y función de Dominios ER-HMGR de retículo endoplasmático en Arabidopsis thaliana

Abstract

La sobreexpresión del dominio de membrana de la Hidroximetil glutaril CoA reductasa (HMGR) en Arabidopsis thaliana desencadena la formación de agregados vesiculares de retículo endoplasmático (RE), esta capacidad morfogénica tiene precedentes claros en levaduras y mamíferos. En A. thaliana dos genes (HMG1 y HMG2) codifican tres isoformas de HMGR (HMGR1S, HMGR1L y HMGR2), las proteínas HMGR1S y HMGR1L derivan del mismo gen y tienen la misma secuencia, pero la isoforma 1L tiene una extensión en N-terminal de cincuenta residuos de aminoácidos, las tres isoformas de la HMGR se insertan co-traduccionalmente en la membrana del RE.

En la presente tesis se determinó la localización subcelular de la HMGR1S de A. thaliana expresando el dominio de membrana de la HMGR1S unido a GFP, se observó que esta proteína quimérica se localiza en el RE formando agregados, con la ayuda de un marcador rojo T3RE, se observó en ensayos de colocalización en N. benthamiana que los agregados de HMGR son parte funcional del RE.

Se determinó la organización estructural de las vesículas de HMGR formadas por el dominio de HMGR1S por primera vez a nivel de ultraestructura en hojas de N. benthamiana, así como también de una línea transgénica de A. thaliana, en este análisis se observaron distintas conformaciones lamelares, de círculos concéntricos y cristaloides presentes en los agregados.

Se realizaron ensayos de inmunolocalización a nivel de la ultraestructura de los agregados de 1SGFP en A. thaliana, con anticuerpos contra GFP y anticuerpos contra el dominio catalítico de la HMGR, y se observó el marcaje de ambos anticuerpos, indicándonos la presencia en estos agregados, tanto de la 1SGFP como de la HMGR endógena, confirmando que el dominio de membrana de HMGR determina su localización subcelular. Los dominios de RE en el que se acumulan 1S:GFP y/o HMGR fueron denominados como Dominios ER-HMGR.

Por otro lado, a pesar de las dificultades técnicas, un estudio anterior sugiere la coincidencia física entre vesículas de HMGR y ER bodies, estas últimas son estructuras derivadas de retículo endoplasmático que cumplen un rol importante en el mecanismo de defensa de las plantas en condiciones de estrés. La identidad estructural y funcional de los ER bodies no ha sido caracterizada aún. En este sentido en la presente tesis se profundizo en el estudio de la coincidencia física y funcional entre vesículas de HMGR y ER bodies, como su caracterización estructural en distintos tipos celulares de A. thaliana. Además, se determinó el papel biológico del dominio de membrana de HMGR en respuesta a estrés utilizando líneas mutantes knock out para el gen HMG1. En este análisis se observó que el gen de la HMGR1 es necesario para la derivación de Dominos ER-HMGR hacia vacuola en respuesta a estrés.

The overexpression of hydroxymetyl-glutaryl CoA reductase (HMGR) membrane domain in Arabidopsis thaliana triggers the endoplasmic reticulum (ER) vesicular aggregates formation, this morphogenetic capability has clear precedents in yeast and mammal cells. In the present thesis, the subcellular localization of A. thaliana HMGR1S isoform was determined through the expression of the HMGR1S membrane domain attached to GFP. This chimerical protein 1S:GFP is localized in the ER forming aggregates, the use of a red lumen ER marker T3RE allowed through colocalization assays in N. benthamiana, determine the 1S:GFP aggregates are a functional part of the ER.

The ultra-structural organization of 1S:GFP aggregates induced by the HMGR membrane domain expression was determined for the first time at this level, in N. benthamiana agroinfiltrated and transgenic lines of A. thaliana. In this analysis, was observed that the 1S:GFP aggregates are conformed by smooth ER membranes distributed with different organization patterns, such as lamellar, whorls and mainly crystalloid.

The immuno localization assays of 1S:GFP aggregates in A. thaliana at ultra-structural level, with anti-GFP and anti-CD1 (CD1:catalytic domain of HMGR1), revealed the presence in ER aggregates of 1S:GFP and HMGR distributed homogenously, therefore these aggregates are a specific domain characterized by the presence of HMGR and denominated as ER-HMGR domain. On the other hand, a previous study suggested the physical coincidence between HMGR vesicles and ER bodies, the last ones are ER derived structures which accumulates specific hydrolytic enzymes and has an important role in plant defense against stress conditions and pathogen attack. In the present work, the study of the physical coincidence between HMGR vesicles and ER bodies and the structural characterization in different tissues and cells was detailed. Additionally, the biologic role of the HMGR1S membrane domain in stress conditions was determined, using HMG1 gene knock out lines. In this analysis it was observed that the HMG1 gene is necessary to derive ER-HMGR domains to vacuole in response to stress conditions.