Contribucions al disseny, síntesi i aplicacions de quimioteques combinatòries de peptoides

Abstract

L'interès principal d'aquesta tesi es centra en la utilització de les tècniques combinatòries per a dissenyar i sintetitzar una quimioteca de peptoides. Els peptoides són un tipus de peptidomimètics amb una estructura general basada en un esquelet de glicinies N-substituídes. Tenen una estructura molt apropiada per a ser sintetitzats en fase sòlida seguint l'estratègia combinatòria del rastreig posicional, basada en la utilització de mescles de reactius en les etapes d'introducció de diversitat. Seguint aquesta estratègia s'ha sintetitzat una quimioteca de mescles controlades de 5120 peptoides (trímers d'N-alquilglicina). <br/><br/>Els peptoides tenen un gran interès en l'àrea biomèdica. Així doncs, el cribratge de la quimioteca de peptoides davant diverses dianes biològiques d'interès terapèutic ha permès la identificació de dos potents neutralitzadors del fenotip d'MDR en l'àrea del càncer, així com de dos potents inhibidors d'LPS en l'àrea del shock sèptic. Aquests compostos han representat un punt de partida per a l'optimització de les seves estructures per a dissenyar nous compostos conformacionalment més restringits que augmentin l'activitat i millorin la selectivitat cap a la diana d'interès.<br/><br/>Per altra banda, s'ha portat a terme l'optimització d'un procés per a obtenir peptoides amb un extrem carboxílic terminal (peptoides àcids), seguint dues estratègies: per hidròlisi de peptoides en dissolució i per síntesi en fase sòlida. L'optimització del procés d'hidròlisi en dissolució s'ha dut a terme mitjançant un disseny d'experiments factorial, obtenint excel·lents resultats de pureses i rendiments, mentre que la síntesi de peptoides àcids en fase sòlida ha implicat treballar amb diversos tipus de resines, sent la clorur de 2-clorotritil la que va donar els millors rendiments i pureses. <br/><br/>L'interès d'obtenir aquest tipus de derivats àcids radica en el fet de poder acoplar els peptoides a suports sòlids, com columnes d'agarosa o sefarosa, així com poder biotinilitzar-los per acoplar-los a columnes d'agarosa amb avidina. Amb aquest tipus de columnes amb el peptoide immobilitzat s'ha utilitzat la tècnica de la cromatografia d'afinitat per a identificar les dianes potencials d'un peptoide d'un extracte proteic que contenia proteïnes de diferent naturalesa.<br/><br/>A partir de l'estudi realitzat per a obtenir peptoides àcids, s'ha dut a terme la realització d'un estudi per obtenir peptoides dímers i de peptoides dímers-cíclics, en fase sòlida i en dissolució. Aquests estudis han constituït un punt d'inici per al plantejament del disseny i síntesi de noves quimioteques combinatòries de mescles, que es realitzarà en un futur pròxim en el nostre grup d'investigació. Aquest tipus de molècules poden resultar ser molt interessants en estudis d'interacció proteïna-proteïna.<br/><br/>Dins del context del cribratge de la quimioteca davant diferents dianes biològiques, s'ha intentat desenvolupar un assaig de fluorescència per a cribrar la quimioteca de peptoides davant la seva capacitat d'inhibir la fosforilació d'un substrat peptídic fluorescent per la proteïna cinasa A. Malauradament, s'ha comprovat que el grup fluoròfor escollit, la 7-amino-4-metilcumarina, adjacent al lloc de fosforilació del pèptid, no ha induït pràcticament cap diferència d'intensitat de fluorescència després de la reacció de fosforilació per la proteïna.<br/><br/>Globalment, aquest treball reflecteix la validesa de la utilització i aplicació de la química combinatòria, en concret de quimioteques de mescles controlades, per a la recerca de compostos amb activitats biològiques. No obstant, en funció de les dades que es coneguin del receptor i/o dels llocs d'interacció, és convenient dissenyar la quimioteca de forma més focalitzada o de forma més diversa. En aquest disseny, tant si és inicial com si és d'optimització d'un cap de sèrie, és cada vegada més evident la importància i necessitat de l'ús d'eines computacionals i d'estudis in silico per cobrir el màxim espai de diversitat i estalviar temps i costos d'experimentació al laboratori.

Peptoids are oligomers of N-substituted glycines residues that have been developed as peptidomimetics but with improved stability and better pharmacological properties. For these reasons, peptoids have also been subjected of application of combinatorial approaches to identify bioactive molecules. <br/><br/>In this context, we have synthesised a combinatorial library of peptoids containing 5120 compounds in 52 controlled mixtures, constructed on solid-phase by using the positional scannig format. <br/><br/>The screening of the peptoid library against different biological targets have identified potent hits. To sum up, two molecules have been rescued from the library with a potent chemosensitiser activity against the MDR phenotype, and two other molecules have been identified with an in vivo neutralizing activity against the Gram-negative lipopolysaccharide (LPS). Optmisation of these hits is in progress to find lead compunds that may become potential drugs.<br/><br/> On the othe hand, we have been interested in expanding the combinatorial chemistry of peptoids to those analogues bearing free carboxylic acid groups, prepared in solution and on solid phase. These compounds are attractive to link to solid-support columns in order to use the affinity cromatography to identify potential targets. As well as this, we have studied the conditions for the efficient linear condensation and cyclocondensation of these acid peptoids.<br/><br/>Finally, we have tried to develop a fluorescent assay for the screening of the peptoid library against the phosphorylation of a fluorescent peptide by the protein Kinase A. However, there has no been detected any difference in the fluorescent intensity with the group 7-amino-4-methylcoumarin, located next to the phosphorilation site.