Formació del motiu quàdruplex bi-loop amb oligonucleòtids lineals i aplicació a la ciclació assistida per motlle

Abstract

Els àcids nucleics poden existir a la natura en una varietat de formes estructurals potencialment rellevants per al funcionament i la regulació dels gens. Aquesta tesi doctoral versa sobre una estructura no canònica del DNA: l'estructura quàdruplex anomenada bi-loop. Es tracta d'un motiu que implica la interacció de dues cadenes que es disposen antiparal·lelament i es mantenen unides per quatre parells de bases intermoleculars. Els parells s'enfronten pel solc menor formant dues tètrades no planes. Aquest motiu havia estat observat en l'estructura cristal·logràfica d'un heptàmer lineal i en les estructures en solució de diversos octàmers cíclics.<br/>Un dels objectius d'aquesta tesi doctoral era aprofundir en l'estudi del bi-loop per tal de determinar-ne els requeriments seqüencials i intentar observar-lo per primera vegada en solució amb oligonucleòtids lineals.<br/>Inicialment s'estudià el motiu bi-loop heterolineal, format per un oligonucleòtid cíclic i un altre lineal, partint de l'heterodímer d<pCAGTCCCT>+d<pCCTTCGGT>. Mitjançant RMN, s'observà que la formació del complex heterolineal és més favorable quan l'oligonucleòtid lineal es troba tallat entre els nucleòtids aparellats. Tot i així, el seu extrem 3' és flexible i un dels parells de bases només es troba parcialment format. En tenir un oligonucleòtid lineal tallat pel llaç, sembla que també s'estructura en forma de bi-loop en presència del motlle cíclic, però aquesta estructuració es perd en allargar-ne els extrems. <br/>Per altra banda, s'ha vist que el bi-loop pot estar estabilitzat per parells no canònics, com els GT. Les dades de RMN permeten afirmar que l'octàmer cíclic d<pCCTTCGGT> s'estructura en forma de bi-loop estabilitzat per una tètrada GTGT directa i una GCGC desplaçada. Un altre octàmer cíclic, d<pTCGTATGT>, pot autoassociar-se de dues formes diferents donant lloc a dos dímers: un estabilitzat per dues tètrades mixtes GCGT desplaçades i el segon estabilitzat per una tètrada GTGT desplaçada i una GCGC desplaçada. <br/>L'observació del motiu en fragments lineals en solució seria de gran importància com a pas previ per a establir-ne la rellevància biològica. Amb aquest objectiu es dissenyaren cinc seqüències lineals derivades d'octàmers cíclics que formen bi-loops força estables però que no poden formar estructures monomèriques. D'aquestes, només dues d'elles s'estructuren en solució en forma de bi-loop: d(TGCTTCGT) i d(TCGTTGCT). La seva estructura es va determinar mitjançant dinàmica molecular restringida i s'assembla molt a totes les estructures de la mateixa família. Aquests dímers, però, són molt menys estables que el seu anàleg cíclic degut al cost entròpic de doblegar les cadenes. <br/>El segon objectiu d'aquesta tesi era emprar el motiu bi-loop com a motlle per a la ciclació assistida. Inicialment es va assajar la ciclació d'oligonucleòtids lineals fosforilats en un dels seus extrems en presència d'un motlle cíclic que afavorís la formació d'un motiu heterolineal, sense èxit. S'observà la massa del producte de ciclació, però aquest no es va poder aïllar, de manera que es conclou que el motiu no és prou estable o és massa flexible. Posteriorment es va assajar la ciclació d'oligonucleòtids lineals fosforilats en 3' que s'autoestructuren en forma de bi-loop. Usant EDC o bromur de cianogen es va poder observar la formació del motiu tant per espectrometria de masses com per electroforesi en gel de poliacrilamida.<br/>Per últim, s'ha intentat aplicar la ciclació assistida per motlle a la fase sòlida, per superar les limitacions de mida del cicle i aprofitar els avantatges de treball i purificació de la fase sòlida, especialment el desancoratge selectiu de les cadenes. No s'ha pogut assolir l'objectiu desitjat degut a la dificultat d'activar un fosfat diester en un medi aquós.

<i>Non-canonical forms of DNA may play important roles in gene function and regulation. This thesis is focused on a type of non-canonical quadruplex called bi-loop. The bi-loop results from interaction of two chains and it is stabilized by four intermolecular base pairs. The base pairs face each other through their minor groove sides giving rise to two non-planar tetrads. This motif has been observed in the crystal structure of a lineal heptamer and in the solution structures of several cyclic octamers.<br/>In this thesis we wished to further define the sequence requirements for the bi-loop formation, and to observe it in solution with linear oligonucleotides for the first time. The study started with the so-called heterolineal complexes, formed by a cyclic octamer and a linear one. Using NMR, we observed that the formation of the bi-loop is favoured when the nick is between the base pairs, although the 3'-end is flexible. We also observed that the bi-loop can be stabilized by non-canonical base-pairs, such as GT. The cyclic octamers d<pCCTTCGGT> and d<pTCGTATGT> form bi-loops stabilized by GT and GC pairs, giving rise to three new types of tetrads (direct GTGT, slipped GTGT and slipped GCGT).<br/>Observation of the motif in solution with linear oligonucleotides would be very important to reinforce its potential biological relevance. For this purpose, five linear sequences that cannot form hairpins were designed. Two of these sequences were found to form a bi-loop motif in solution: d(TGCTTCGT) and d(TCGTTGCT). Their structures were solved by RMD and proved to be very similar to those formed by cyclic molecules, though less stable due to the entropic cost.<br/>Secondly, we wanted to use the bi-loop motif as a template for assisted cyclization. We started with the heterolineal complexes and we were not lucky in achieving the ligation. In contrast, we succeeded in the cyclization of linear phosphorylated oligonucleotides that formed bi-loop homodimers. <br/>Finally, the solid-phase template-directed cyclization of oligonucleotides was also assayed. We were not successful because of the difficulty in activating a phosphate diester moiety in an aqueous medium. </i>