Nuevos mecanismos de regulación hepática mediados por miR-33 y el receptor de las lipoproteinas de baja densidad

Abstract

El hígado es un órgano que presenta una gran capacidad regenerativa. Para estudiar este fenómeno, el modelo de hepatectomía parcial en ratón es el más adecuado (Higgins GM, Anderson RM. Arch Pathol. 1931). Esta técnica, conjuntamente con el uso de modelos animales modificados genéticamente, nos puede facilitar el estudio de las diferentes moléculas o vías de señalización implicadas en el proceso de regeneración hepática.

La resección hepática es una de las medidas terapéuticas más efectivas para el tratamiento del carcinoma hepatocelular. Uno de los problemas a los que se enfrentan estos pacientes es que la aparición de un hepatocarcinoma se asienta sobre un hígado fibrótico o cirrótico. En este contexto clínico, la técnica de la resección se ve comprometida debido a que el hígado cirrótico regenera deficientemente (Bège T, et al. J Gastrointest Surg. 2007). Por este motivo, el procedimiento quirúrgico está asociado a un índice muy elevado de mortalidad (entre el 20 y el 50% según diversos autores). Es por ello, que hipotetizamos que el estudio de la regeneración hepática y el hallazgo de nuevas vías de señalización implicadas en este proceso, posibilitarán el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad hepática crónica. En este contexto, creemos que el estudio de las vías de regulación del metabolismo lipídico hepático tienen más potencialidad terapéutica. Por ejemplo, se ha demostrado que el colesterol es importante en la proliferación celular y se conoce que su deficiencia evita la progresión de las células a través del ciclo celular. Se sabe que cuando hay una acumulación de esteroles, disminuyen la actividad de la proteína HMGCR (HMG-coA reductasa) una enzima limitante en la síntesis del colesterol) y la expresión del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Por el contrario, cuando disminuyen los niveles de colesterol las células mantienen la actividad de la proteína HMGCR y aumenta la expresión del receptor LDL (LDLR). Todo este proceso está regulado por el factor de transcripción SREBP (Brown MS et al. Cell, 1997 y Espenshade PJ. J Cell Sci. 2006). A parte de la implicación del colesterol en la regulación del ciclo celular, también es conocido que durante la regeneración hepática se acumulan grandes cantidades de lípidos en forma de gotas llamadas lipid droplets, las cuales están compuestas mayoritariamente por colesterol y ésteres de colesterol. (Garcia-Arcos I. et al. Lipids. 2010). Aun no se conocen con exactitud los mecanismos y la funcionalidad de esta esteatosis transitoria, ni los mecanismos a través de los cuales la célula es capaz de acumular lípidos durante el proceso regenerativo. Lo que si se ha observado es que tras la hepatectomía parcial existe un descenso de lípidos en el suero, y un aumento de la expresión del gen LDLR. Estos datos sugieren que este receptor estaría involucrado en el transporte de los lípidos hasta el interior de la célula. (Bocchetta M. et al. J Cell Physiol. 1993).

Teniendo en cuenta los antecedentes descritos, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue el de investigar como afecta el metabolismo lipídico al ciclo celular y a la regeneración hepática. Específicamente, la tesis se ha dividido en dos estudios:

PRIMER ESTUDIO:

- El miR-33 se encuentra en el mismo locus genómico que el gen Srebp, y se ha demostrado que este gen regula el ciclo celular. Por lo tanto el objetivo general del primer estudio fue: - Estudiar el papel del miR-33 en la regulación del ciclo celular y su implicación en la regeneración hepática. Objetivos específicos: 1. Estudiar la función de miR-33 en la regulación de las CDKs y las ciclinas y, por tanto, su papel en la regulación del ciclo celular. 2. Identificar posibles dianas de interacción de miR-33 con el 3’UTR de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs). 3. Caracterizar la función del miR-33 durante la regeneración hepática en ratones a los que se les ha practicado una hepatectomía parcial.

SEGUNDO ESTUDIO:

La hipótesis específica del segundo estudio plantea que la actividad del receptor de las LDL afecta al lipidoma del hepatocito durante el proceso de regeneración hepática. Por lo tanto el objetivo general del estudio fue: • Analizar el efecto de la deficiencia del receptor LDL en la formación de lipid droplets y en la proliferación hepatocelular durante la regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial.

Los resultados obtenidos en el primer estudio se resumen en: 1. El miR33 regula la expresión post-transcripcional de la ciclina dependiente de quinasa CDK6 y de la ciclina D1.

2. miR33 se une de manera directa al 3’UTR de los mRNA de Cdk6 y Ccnd1.

3. El miR33 regula la proliferación celular y la progresión del ciclo celular.

4. El antagonismo de miR33 en ratones promueve la regeneración hepática.

Los resultados obtenidos en el primer estudio se resumen en: 1. Los ratones LDLR-/- presentan esteatosis y niveles elevados de colesterol circulante.

2. Los ratones LDLR-/- presentan una peor regeneración hepática y presentan una disminución de la función hepática tras la PHx.

3. Los LDLR-/- presentan una alteración en la progresión del ciclo celular y una menor expresión de IL-6, TNF-α y HGF durante la regeneración hepática.

4. La deficiencia del gen LDLR no interfiere en la formación de los lipids droplets pero si en la composición de los mismos.

Considerando los resultados presentados en esta Tesis Doctoral formulamos las siguientes conclusiones: 1. miR-33 regula la expresión de los genes Cdk6 y Ccnd1. 2. La regulación de los genes Cdk6 y Ccnd1 se lleva a cabo mediante la unión específica de miR-33 al los transcritos de estos genes. 3. miR-33 regula la proliferación celular de hepatocitos mediante la inhibición de la expresión de Cdk6 y Ccnd1. 4. El tratamiento de ratones hepatectomizados con anti-miR-33 estimula la regeneración hepática. 5. Los ratones deficientes en LDLR presentan una regeneración hepática anómala tras el procedimiento quirúrgico de la hepatectomia parcial. 6. Los ratones deficientes en LDLR muestran una disminución significativa de la función hepática en las etapas iniciales del proceso de regeneración tras una PHx. 7. Los ratones deficientes en LDLR presentan una desregulación de los niveles de IL-6, TNF-alfa y HGF hepáticos durante la regeneración hepática. 8. Los ratones deficientes en LDLR muestran una disminución de la expresión hepática de marcadores de ciclo celular. 9. La deficiencia del gen LDL modifica el lipidoma hepático pero no compromete la formación de lipid droplets. 10. El hígado en regeneración de los ratones deficientes en LDLR-/- presenta una concentración de ésteres de colesterol, colesterol y fosfatidilcolina compatible con un estado quiescente; en contraposición a la composición del lipidoma que predomina en los hígados regenerativos.

Considerando las conclusiones expuestas, nuestros datos sugieren que miR-33 tiene potencialidad terapéutica como modulador de la regeneración hepática en el contexto clínico. Además, creemos que el estudio del lipidoma hepático, previo o inmediatamente posterior a la resección hepática, permitiría prever posibles complicaciones hepáticas en pacientes a los que se les ha practicado una hepatectomía terapéutica.

Liver shows a well-known regenerative capacity. To study this phenomenon, the partial hepatectomy in rodents has been shown to be the most suitable model. This technique, in combination with the use of genetically modified animal models, can accelerate the study of different molecules or signaling pathways involved in the regeneration process.

One of the signaling pathways that potentially have a therapeutically impact are the regulatory pathways of hepatic lipid metabolism. It has been demonstrated that cholesterol is important in cell proliferation and it is known that deficiency prevents the progression of cells through the cell cycle. This process is regulated by the transcription factor SREBP.

It is also known that during liver regeneration, there is an accumulation of large amounts of lipids in the form of drops called lipid droplets, which are composed largely of cholesterol and cholesterol esters. It has been observed that after a partial hepatectomy there is a reduction of lipid levels in plasma, and increases the expression of the LDLR gene, suggesting that this receptor might be involved in the transport of lipids through the cell.

The overall objective of this thesis was to assess how the lipid metabolism affects the cell cycle during liver regeneration at two different levels.

- To study the role of miR-33, a micro RNA encoded in an intronic region of the SREBP gene, in cell cycle regulation and its implication in liver regeneration.

-Using genetically modified LDLR-/- mice, analyze the effect of the deficiency of the LDL receptor in the formation of lipid droplets and hepatocellular proliferation during liver regeneration induced by partial hepatectomy.

As the results, this thesis proves that miR-33 regulates the post-transcriptional expression of CDK6 and C1 by binding specifically at the 3`UTR of both mRNAs. Therefore miR-33 itself regulates the cell proliferation and cell cycle. A synthetic antagonist of miR-33 stimulates liver regeneration in healthy mice.

On the other hand LDLR-/- mice show a deficient liver regeneration and a deficient hepatic function after a partial hepatectomy. Biochemistry and molecular analyses indicate that these mice show altered cell cycle and a decreased expression of different growth factors (IL-6, TNF-alpha and HGF) in the event of hepatic damage. Although LDLR-/- mice are able to form lipid droplets, there are significatively changes on its composition and might be used as an indication of the liver regeneration potential or its performance

Our data suggests that miR-33 is an hepatic regeneration modulator and can become a future target molecule in the clinical context because its therapeutical potential. Furthermore the study of hepatic lipidome on patients that need to undergo hepatic surgery might be a tool to foresee failure and decreases the mortality and morbidity of hepatectomy as a therapeutic tool.