Mechanisms of cytokine release induced by electronegative LDL in monocytes. The role of ceramide and the receptors CD14-TLR4

Abstract

L’LDL electronegativa (LDL(-)) és una LDL modificada present en circulació amb propietats inflamatòries incloent la inducció de l’alliberament de citoquines en cèl·lules relacionades amb l’arteriosclerosi, tals com monòcits i cèl·lules endotelials. Es coneix poc sobre les vies intracel·lulars activades per l’LDL(-), en especial en monòcits. En aquesta tesi s’han estudiat els primers passos a través dels quals l’LDL(-) indueix l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 en monòcits humans. Concretament, s’han estudiat els components inflamatoris de l’LDL(-) i la seva interacció amb receptors cel·lulars de monòcits. En relació amb els components inflamatoris, es va observar que la ceramida (CER) és, en part, responsable dels efectes inflamatoris de l’LDL(-). La CER es relaciona amb un augment en la susceptibilitat a l’agregació de l’LDL(-) i a la seva inducció de citoquines en monòcits. Aquestes propietats de l’LDL(-) augmenten a 37ºC i disminueixen per la incubació d’aquesta lipoproteina amb l’HDL. El contingut en CER en l’LDL(-) augmenta per acció de l’activitat tipus fosfolipasa C (PLC), intrínseca en l’LDL(-) i que també es veu inhibida per l’HDL. Aquest fet suggereix que l’activitat PLC de l’LDL(-) participa en les modificacions que tenen lloc en l’LDL nativa (LDL(+)) per a la formació de LDL(-). L’enriquiment d’LDL en CER (CER-LDL)) i el tractament d’LDL amb PLC promouen una LDL que mimetitza l’alliberament de citoquines de l’LDL(-). Tanmateix, l’efecte de la CER-LDL és menor al de l’LDL(-), proposant la possible acció d’altres components en l’LDL(-) que podrien contribuir al seus efectes inflamatoris. En l’estudi dels receptors involucrats en l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 induït per l’LDL(-) en monòcits es va determinar que CD14 i TLR4 juguen un paper central. L’adició dels anticossos antiTLR4 i antiCD14 va disminuir un 70%-80% l’alliberament de citoquines, mentre que antiTLR2 va disminuir l’alliberament sols en un 15-25%. L’alliberament de citoquines també va disminuir al tractar les cèl·lules amb un inhibidor específic de TLR4. Aquest alliberament de citoquines va augmentar en la línia de monòcits THP1 que sobreexpressen CD14 (THP1-CD14). Aquests resultats es van confirmar per silenciament gènic de TLR4 i CD14. Experiments d’unió van mostrar que l’LDL(-) presenta una gran afinitat per CD14 i TLR4; la neutralització d’aquests receptors va disminuir la quantitat d’LDL(-) unida a monòcits. Per immunoassaig es va demostrar que CD14 és el principal receptor involucrat en la unió de LDL(-). L’LDL(-) uneix CD14, es forma un complex amb TLR4 i d’aquesta manera s’activa la senyalització intracel·lular que donarà lloc a l’alliberament de citoquines per aquestes cèl·lules. L’LDL(-) pot, d’altrabanda, interaccionar directament amb TLR4 per activar la senyal intracel·lular. CD14 i TLR4 són receptors que mitjancen l’alliberament de citoquines induït pel lipopolisacàrid (LPS) present en la membrana bacteriana. Els resultats mostren una competència entre LDL(-) i LPS tant per l’efecte inflamatori com per la unió al receptor CD14 de monòcits i de plaques multipou recobertes de CD14. Aquesta competència podria representar una acció compensatòria de l’LDL(-) en casos d’excessiva inflamació. El contingut augmentat en CER present en l’LDL(-) sembla ser el responsable de l’activació del sistema CD14-TLR4, el qual provoca l’alliberament de citoquines en monòcits. L’alliberament de citoquines induït per la CER-LDL en monòcits va disminuir per l’adició de l’inhibidor de TLR4. La secreció de citoquines induïda per la CER-LDL és similar a la de l’LDL(-), excepte pel fet que la CER-LDL no pot activar l’alliberament de citoquines directament per TLR4 i necessita CD14 per a aquest efecte. En conclusió, l’augment del contingut en CER per l’LDL(-) exerceix un paper central en l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 a través de CD14- TLR4 en monòcits.

Electronegative LDL (LDL(-)) is a minor modified LDL present in circulation with pro-inflammatory effects, including the induction of cytokine release in cells involved in atherosclerosis, such as endothelial and mononuclear cells. However, the cellular pathways activated by LDL(-) are scarcely understood, particularly in monocytes. In this thesis, we aimed to determine the first steps of the mechanisms by which LDL(-) induces IL-6, IL-10 and MCP-1 release in human monocytes. We focussed the study on the inflammatory components of LDL(-) and their interaction with cell receptors in monocytes. Regarding the inflammatory components, we found that ceramide (CER) is, in part, responsible for the inflammation promoted by LDL(-). CER has been related to the increased LDL(-)-susceptibility to aggregation and the induction of cytokine release in monocytes. These properties of LDL(-) are enhanced at 37ºC and diminished by the incubation of this lipoprotein with HDL. CER levels increase in LDL(-) because of the LDL(-)-intrinsic PLC-like activity, which is also counteracted by HDL. This suggests that PLC-like activity of LDL(-) participates in the modifications undertaken in native LDL (LDL(+)) to form LDL(-). The enrichment of LDL with CER (CER-LDL) and its treatment with PLC-like activity mimics the cytokine secretion of LDL(-), although the effect of CER-LDL does not reach that of LDL(-). This suggests that other components linked to LDL(-) could contribute to its inflammatory effects. The study of the receptors involved in the IL-6, IL-10 and MCP-1 release induced by LDL(-) in monocytes revealed that CD14 and TLR4 were pivotal. The addition of antiTLR4 and antiCD14 antibodies decreased cytokine release by 70%-80%, whereas that of TLR2 inhibited it by 15%-25%. The cytokine release was also diminished when cells were treated with a specific TLR4 inhibitor, but this release increased in a monocytic THP1 cell line overexpressing CD14 (THP1-CD14). These results were confirmed by TLR4 and CD14 gene silencing studies. Binding studies showed that LDL(-) presents high affinity to CD14, and in a lesser extent to TLR4; the neutralisation of these receptors decreased the amount of LDL(-) bound to monocytes. Immunoassay techniques elucidated that CD14 is the main receptor involved in LDL(-) binding. LDL(-) binds to CD14 and, then, form a complex with TLR4 to activate the intracellular signalling leading to cytokine release in these cells. However, LDL(-) can alternatively interact with TLR4 to activate the intracellular signalling. CD14 and TLR4 are receptors that mediate the cytokine release induced by the lipopolysaccharide (LPS) present in the bacterial membrane. The results showed a competition between LDL(-) and LPS for both the inflammatory effect and the binding to CD14 receptor in monocytes and in CD14-coated microtiter wells. This competition could represent an LDL(-)-counteracting role in cases of overwhelming inflammation. The increased content of CER present in LDL(-) seems to be responsible for the activation of the CD14-TLR4 system which leads to cytokine secretion in monocytes. The cytokine release induced by CER-LDL in monocytes decreased with the addition of the TLR4 inhibitor. The CER-LDL-induced cytokine secretion in THP1-CD14 cells was much greater than in THP1 cells, which showed almost null cytokine release. This behaviour of CER-LDL is similar to LDL(-), excepting the fact that CER-LDL is not able to induce its cytokine release directly through TLR4 and needs CD14 for this effect. To sum up, the increased content of CER present in LDL(-) plays a key role in the induction of IL-6, IL-10 and MCP-1 release through CD14-TLR4 in monocytes.