Especificidad de las poblaciones neuronales activadas en respuesta a distintos estímulos estresantes emocionales

Abstract

La exposición a estímulos estresantes de tipo emocional induce activación neuronal en muchas regiones del SNC que cursa en paralelo con una estimulación del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA). La activación neuronal suele valorarse mediante la inducción de genes de expre-sión temprana como c-fos, mientas que la activación del eje HPA se basa en la expresión del factor liberador de corticotropina (CRF) en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) y en la liberación de hormonas como la ACTH y los glucocorticoides. Numerosos estudios sugieren que la expresión de c-fos y CRF alcanza un máximo alrededor de los 15-30 min de iniciada la exposición al estrés, para disminuir posteriormente a pesar de la persistencia del estímulo estre-sante. Esta disminución de la respuesta podría obedecer a cambios en las señales estimuladoras y/o inhibidoras que llegan a la neurona como consecuencia de la exposición prolongada al mis-mo estímulo estresante, o bien a mecanismos de represión intracelular. Razonamos que si la hipótesis de los cambios en las señales es correcta, la expresión de dichos genes se restablecería en gran medida en respuesta a un nuevo estímulo estresante, en tanto que si la segunda hipótesis es la válida, la expresión debería estar bloqueada. Utilizando la rata como modelo, hemos estudiado en un primer experimento mediante hibrida-ción in situ (ISH), los cambios en la expresión de c-fos y CRF, y los cambios en los niveles plas-máticos de ACTH y corticosterona tras la exposición prolongada (unas 4 h) a una inmoviliza-ción en plancha (IMO) y cómo esta exposición a la IMO afecta a la respuesta a un nuevo estímu-lo estresante (nado forzado). Los resultados de expresión de c-fos indicaron que en la corteza prefrontal medial (mPFC), el septum lateral ventral (LSv) y la amígdala medial (MeA) la res-puesta al nado tras la IMO prolongada es capaz de restablecerse en gran medida, dando validez a la hipótesis de una reducción de las señales que llegan a las neuronas. Sin embargo, en el PVN la expresión de c-fos en respuesta al nado tras la IMO prolongada se encuentra en su mayor parte bloqueada, sugiriendo un bloqueo intracelular. En consonancia con los resultados de expresión de c-fos en el PVN, tanto la expresión de CRF como la secreción de ACTH en respuesta al nado se encuentran totalmente bloqueadas tras la IMO prolongada. Una interpretación correcta de estos primeros resultados, precisa conocer si las poblaciones neuronales activadas durante la IMO prolongada coinciden o no con las que responden al nado tras esta IMO. Al objetivo de identificar estas neuronas hemos realizado un nuevo experimento similar al anterior pero incluyendo un grupo de animales que fue liberado de la IMO prolonga-da y re-expuesto a una nueva IMO. La finalidad de este grupo era diferenciar la activación debi-da exclusivamente al nado de la que pudiera producirse por otros procesos como la simple ma-nipulación del animal o la propia liberación de la IMO. Para identificar las poblaciones neuro-nales que responden a la IMO prolongada y al nado, hemos realizado un doble marcaje de la proteína c-Fos y el mRNA que codifica para esta proteína mediante inmunofluorescencia e ISH fluorescente (IF-FISH). Basándonos en la dinámica de ambos marcadores, las neuronas que responden a la IMO prolongada mostrarían fundamentalmente proteína y poco o nulo mRNA, mientras que las que responden al nado aplicado tras esta IMO mostrarían fundamentalmente mRNA y nula proteína. Tras este análisis hemos observado que en regiones como el mPFC, el LSV y la MeA, la exposición al nado tras la IMO prolongada provocó la activación de nuevas neuronas sugiriendo cierta especificidad en la respuesta a ambos estímulos estresantes. Sin em-bargo, en el PVN con la exposición al nado tras la IMO prolongada no provocó activación de nuevas neuronas, confirmando la existencia de una sola población neuronal que responde indis- tintamente frente a estímulos estresantes de distinta naturaleza que es bloqueada tras una esti-mulación prolongada. Una gran parte de la activación neuronal observada en términos de expresión de c-fos en res-puesta a los distintos estímulos estresantes podría deberse a procesos de activación generalizada o de arousal que enmascararía aquellas neuronas que son realmente importantes en la respuesta al estrés. En un último experimento hemos pretendido disminuir la aportación del arousal, ad-ministrando a nivel sistémico DSP-4, una neurotoxina altamente selectiva para las terminales noradrenérgicas provenientes del LC. Una semana después de la administración de DSP-4, ex-pusimos a los animales a estímulos estresantes de diferente intensidad (ambiente nuevo, olor al depredador e IMO) para posteriormente analizar la expresión de c-fos mediante FISH en el mPFC, el LSv, la MeA y el PVN. El alcance de la lesión sobre las terminales noradrenérgicas del LC se valoró mediante inmunoflorescencia de la dopamina beta-hidroxilasa (DβH). En concor-dancia con datos de la literatura, sólo en el mPFC y la MeA se pudo apreciar una disminución en las terminales noradrenérgicas. La lesión con el DSP-4 no tuvo un impacto sobre la expresión de c-fos en respuesta a los distintos estímulos estresantes, salvo en la respuesta del LSv a la IMO donde se observó una disminución. En conjunto, los resultados sugieren que en la reducción de la expresión de c-fos observada tras la exposición prolongada a un estímulo emocional pueden intervenir tanto la familiarización con el estímulo y la consiguiente reducción de las señales estimuladoras como la represión in-tracelular de la expresión del gen. La contribución de cada uno de los mecanismos es marcada-mente dependiente del área estudiada. Por otro lado, parecen existir poblaciones de neuronas que responden específicamente a la IMO y al nado, aunque muchas de ellas pueden ser comunes a ambos. En la respuesta del eje HPA podrían añadirse bloqueos adicionales que probablemente contribuyen a reducir el posible impacto negativo de una liberación excesiva de glucocorticoi-des. El escaso impacto de la administración de DSP-4 podría explicarse por la existencia de me-canismos compensatorios y por lo tanto sería necesario valorar otras alternativas para disminuir la aportación del arousal a la respuesta de estrés.

Exposition to emotional stressful stimuli leads to neuronal activation of several regions of the Central Nervous System (CNS) that converge into the stimulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA). This neuronal activation can be measured by the induction of early expression genes (IEG) such as c-fos, while the activation of the HPA axis can be measured by the expression of the corticotrophin-releasing-factor (CRF) in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) and also by the release of hormones such as ACTH and glucocorti-coids. There are several studies that suggest the expression of c-fos and CRF to reach its maxi-mum around 15-30 min after initiation of the exposition to stress. A decline in these parameters is observed even with the persistence of the stressful stimuli. This decline could be due to chang-es in the stimulatory/inhibitory signals arriving to the neurons as a consequence of a prolonged exposition to the same stressful stimuli, or it could also be due to intracellular repression mech-anisms. If the former hypothesis is correct, the expression of such genes would be mostly reestablished in response to new stressful stimuli, however, if the second hypothesis is valid, the expression should be blocked. In a first experiment we studied changes in the expression of c-fos and CRF in the rat CNS and changes in plasma levels of ACTH and corticosterone after a prolonged exposure (4 h approx.) to immobilization (IMO). We then assessed how this exposure could affect the response to a new stressor (forced swim). The results of expression of c-fos indicated that in the medial pre-frontal cortex (mPFC), the ventral lateral septum (LSv) and the medial amygdala (MeA) the response after prolonged IMO can be greatly restored, validating the hypothesis of a reduction of signals arriving to the neurons. However, in the PVN, the c-fos expression in response to forced swimming after prolonged IMO is largely blocked, suggesting an intracellular repression. Corroborating the results of c-fos expression in the PVN, the expression of CRF and ACTH secretion in response to forced swim are completely blocked after prolonged IMO. A correct interpretation of these first results requires knowing whether the neuronal popula-tions activated during prolonged IMO are the same as those responding to the forced swim ap-plied after the prolonged IMO. In order to identify these neurons we performed a new experi-ment which was similar to the previous one but including a new group of animals that was re-exposed to a second IMO instead of the forced swim. The purpose of this group was to differen-tiate activation due exclusively to forced swim from the one that could be produced by other processes such as the simple manipulation of the animal or the release of IMO. To identify the neuronal populations that respond to prolonged IMO and forced swim, we have performed a double labeling of c-Fos protein and its mRNA. Given the dynamics of both markers, the neu-rons which respond to the prolonged IMO would show essentially protein and little or no mRNA, while those responding to forced swim applied after this IMO would show essentially mRNA and no protein. After this analysis we found that in regions such as the mPFC, LSV and MeA, exposure to forced swim after prolonged IMO triggered activation of new neurons sug-gesting some specificity in the response to both stressors. However, in the PVN exposure to forced swim after the prolonged IMO did not cause activation of new neurons, confirming the existence of a single neuronal population that responds similarly to different stressful stimuli, by which activation is inhibited after prolonged stimulation. A great part of the neuronal activation observed in terms of expression of c-fos in response to various stressful stimuli could be due to generalized activation or arousal processes. This activa- tion could mask those neurons that are really important in the stress response. In a final experi-ment we tried to decrease the contribution of arousal administrating DSP-4, a neurotoxin that is highly selective for LC noradrenergic terminals. One week after the administration of DSP-4, we exposed the animals to stressful stimuli differing in intensity (new enviroment, predator odor and IMO) and then we analyzed the expression of c-fos in the mPFC, LSV, MeA and PVN . The extent of the lesion on the noradrenergic terminals of LC was assessed by immunofluorescence of dopamine beta-hydroxylase (DβH). We observed only a decrease in noradrenergic terminals in the mPFC and MeA supporting data found in the bibliography. The DSP-4 lesion had no effect on the expression of c-fos in response to various stressors, except in the LSV in animals exposed to IMO where a decrease was observed. The results of this work suggest that the reduction of c-fos expression observed after prolonged exposure to an emotional stimulus may involve both familiarization with the stimulus, with the consequent reduction of stimulatory signals, as well as an intracellular repression of this gene. The contribution of each mechanism seems to be markedly dependent of each region con-cerned. On the other hand, it seems to exist neuronal populations that respond specifically to IMO and forced swim, although many of them may be common to both. The HPA axis response could probably include additional blockages that may help to reduce the negative impact of an excessive glucocorticoid release. The limited impact of the DSP-4 administration could be ex-plained by the existence of compensatory mechanisms, therefore other alternatives to reduce the contribution of arousal to stress response should be considered.