Estudi dels telòmers de les cèl·lules germinals de mamífer. Caracterització de l’rna telomèric terra i de la telomerasa

Abstract

Els telòmers són estructures ribonucleoproteiques formades per repeticions en tàndem TTAGGG, un complex proteic específic (shelterina), i RNA telomèric no codificant (TERRA), que es localitzen als extrems dels cromosomes eucariotes per prevenir la inestabilitat genòmica i les fusions entre cromosomes. En les cèl·lules germinals, el manteniment de l’estructura telomèrica és crucial per a la correcta progressió de la gametogènesi, ja que els telòmers participen en l’aparellament entre cromosomes homòlegs durant la profase I de la meiosi, i promouen la sinapsi i la recombinació entre ells. De fet, la disrupció de l’homeòstasi telomèrica provoca l’apoptosi de les cèl·lules germinals i/o la generació d’aneuploïdies, i està altament relacionada amb la senescència reproductiva. No obstant, poc se’n sap dels mecanismes encarregats de preservar l’estructura i longitud telomèrica al llarg de la gametogènesi dels mamífers. Per aquest motiu, tenint en compte que TERRA és un component integral de l’estructura telomèrica, i que la telomerasa és el complex enzimàtic que allarga els telòmers, en aquest treball es va plantejar l'estudi de la implicació d’aquestes dues molècules en la preservació de l’homeòstasi dels telòmers en les cèl·lules germinals de mamífer. Amb aquest objectiu, es van analitzar cèl·lules germinals humanes i de ratolí al llarg de la gametogènesi mitjançant tècniques citogenètiques i moleculars. Els nostres resultats mostraren que tant TERRA com el component proteic de la telomerasa (TERT) es localitzaven als telòmers de les cèl·lules germinals. La distribució nuclear de TERRA estaria subjecta a un llindar dependent dels nivells cel·lulars de TERRA i del gènere de la cèl·lula (oòcit o espermatòcit), mentre que la transcripció de TERRA dependria de l’estadi de la gametogènesi i de l’estat del mateix telòmer. D’altra banda, TERT es trobava majoritàriament als telòmers de les cèl·lules germinals, sobretot en ratolí, tot i que no s’observà l’elongació dels telòmers al llarg de la gametogènesi. Alhora, la (baixa) co-localització entre TERRA i TERT als meiòcits humans i de ratolí es produïa majoritàriament fora del complex telomèric. De la mateixa manera, es va analitzar la distribució de TERRA i TERT en espermatòcits de pacients diagnosticats amb infertilitat idiopàtica d’origen no obstructiu, els quals mostraren un menor nombre d’esdeveniments de recombinació en comparació amb els espermatòcits control. S’observà una reducció en els nivells de TERRA conjuntament amb una disrupció de la distribució telomèrica de TERRA i TERT en les cèl·lules dels individus infèrtils: mentre TERRA tendia a localitzar-se als telòmers, TERT tendia a dissociar-se’n. No obstant, ni el nombre de repeticions telomèriques ni l’associació de TERRA i TERT es veien afectades. Per tant, en base als nostres resultats, proposem que TERRA i TERT s’associarien amb els telòmers de les cèl·lules germinals humanes i de ratolí per tal de participar en el manteniment de l’estabilitat de l’estructura telomèrica durant els complexos esdeveniments cromosòmics que tenen llocs durant la meiosi i la gametogènesi. Alhora, donat que l’homeòstasi d’aquestes dues molècules es veu alterada a les cèl·lules germinals de pacients infèrtils, el seu anàlisi en meiòcits, conjuntament amb d’altres paràmetres, podria ser útil per a la determinació de l’origen de la infertilitat humana.

Telomeres are ribonucleoprotein complexes, composed by TTAGGG tandem repeats, a telomere-specific protein complex (shelterin) and telomeric noncoding RNA (TERRA) that cap the ends of eukaryote chromosomes preventing them from genomic instability and fusions. In mammalian germ cells, the maintenance of the telomeric structure is crucial for the proper progression of gametogenesis since telomeres are involved in homologous chromosomes pairing during the meiotic prophase I, also promoting their synapsis and recombination. In fact, disruption of telomere homeostasis leads to germ cells apoptosis and/or aneuploidy, and has been strongly related to reproductive aging. However, little is known on the mechanisms preserving telomere structure and length during mammalian gametogenesis so far. Thus, taking into account that TERRA is an integral component of the telomeric structure, and that telomerase is the enzymatic complex that elongates telomeres, the main objective of this work was to investigate whether these two molecules are implicated in the preservation of telomere homeostasis of mammalian germ cells. To this aim, mouse and human germ cells were analyzed by cytogenetic and molecular techniques throughout gametogenesis. Our results showed that both TERRA and the protein component of telomerase (TERT) localized at telomeres of germ cells. The distribution of TERRA in the nucleus would be subjected to a threshold that would depend on TERRA cellular levels and the cell gender (i.e. oocyte or spermatocyte), whereas TERRA transcription would be regulated according to the gametogenic stage and the telomere status per se. On the other hand, TERT highly localized at germ cells telomeres, especially in mouse, although no telomere elongation was observed in these cells throughout gametogenesis. Moreover, (scarce) TERRA and TERT co-localization occurred out of the telomeric complex in mouse and human meiocytes. In the same way, TERRA and TERT distribution was analyzed in human spermatocytes from patients diagnosed with idiopathic non-obstructive infertility, which showed fewer recombination events compared to spermatocytes of a control donor. A reduction in TERRA levels together with a disruption of the telomeric distribution of TERRA and TERT was observed in cells of infertile individuals. While TERRA was prone to localize at telomeres, TERT tended to dissociate from them. Nevertheless, neither the number of telomeric repeats nor TERRA-TERT association was affected in spermatocytes of infertile patients. Therefore, in the light of our results, we propose that TERRA and TERT would associate with telomeres of mouse and human germ cells to participate in the maintenance of the stability of telomere structure during the complex chromosome events taking place throughout meiosis and gametogenesis. Moreover, since the homeostasis of these two molecules is disrupted in germ cells from infertile patients, they could be useful to determine of the origin of human infertility by their analysis in meiocytes together with other parameters.