Initiation, progression and extension of parkinson’s disease: role of α-synuclein

Abstract

La malaltia de Parkinson és un trastorn neurodegeneratiu freqüent d’origen desconegut que es caracteritza principalment per la pèrdua de neurones dopaminèrgiques de la substància nigra pars compacta (SNpc) i la presencia d’inclusions proteiques intacitoplasmàtiques anomenades cossos de Lewy (CL), en diverses regions cerebrals afectades. Tot i que els CL es van descriure per primera vegada fa una dècada, encara es desconeix la seva rellevància en el procés patològic de la MP. Recentment s’ha suggerit que l’ α-synucleina, el principal component dels CL, pot iniciar i extendre el procés patològic de la MP. Reforçant aquesta idea, la injecció intracerebral de fibrilles sintètiques d’α-synucleina recombinant poden iniciar una patologia de l’ α-synucleina en ratolins. Tot i així, encara es desconeix si aquest efecte patogènic de l’ α-synucleina recombinant sintètica es pot aplicar també a l’α-synuclein humana associada a la MP i ocórrer en especies més properes als humans. En aquesta tesis em tractat aquesta qüestió avaluant el possible efecte patogènic d’inocular extractes de CL nigrals que contenen α-synucleina i que han sigut obtinguts de pacients amb MP, en el cervell de ratolins i macacs. Aquests CL nigrals van ser purificats de cervells postmortem de pacients amb MP mitjançant un fraccionament de gradient de sucrosa i posteriorment es van inocular en la SNpc o estriat de ratolins i macacs. En ambdues espècies, les inoculacions intranigrals o intraestriatals dels extractes de CL derivats de pacients amb MP van provocar una neurodegeneració nigrostriatal progressiva que va començar als terminals dopaminèrgics de l’estriat. En animals injectats amb CL, l’α-synucleina humana exògena va ser ràpidament internalitzada per les neurones de l’hoste i va iniciar la conversió patològica de l’α-synucleina endògena. Al principi del procés neurodegenetiu induït pels CL, l’α-synucleina patològica del hoste es va acumular de manera difusa en les neurones de la SNpc i de regions cerebrals interconectades anatòmicament. Els efectes patogènics induïts pels CL van requerir tant l’α-synucleina present als CL com l’expressió d’α-synucleina endògena del hoste. Aquests resultats indiquen que les espècies humanes d’ α-synucleina presents en els CL derivats de pacients amb MP són patogènics i tenen la capacitat d’iniciar un procés patològic semblant a la MP. Reforçant el rol patogènic de l’α-synucleina en la MP, s’ha descrit que els pacients amb MP contenen nivells incrementats d’aquesta proteina. En aquest sentit, la utilització d’eines molecular capaces de revertir l’expressió anormal d’α-synucleina a nivells fisiològics podria ser beneficiosa per la MP. Basant-nos en aquesta hipòtesis, el segon objectiu d’aquesta tesis era determinar la viabilitat i seguretat de disminuir l’expressió d’α-synucleina in vivo específicament en poblacions neuronals vulnerables en la MP mitjançant l’administració intranasal de small interferring RNA (siRNA. Per aconseguir-ho, primer de tot vam fer un screening in vitro de diferents siRNA per seleccionar aquells siRNA capaços de disminuir els nivells basals o sobreexpressats d’α-synuclein sense disminuir els nivells de β- ni γ-synucleina. A continuació, vam confirmar que la molècula seleccionada (SNCA499-siRNA) era capaç de disminuir els nivells de mRNA de la SN in vivo després de la infusió local en la SN de ratolins. Aquesta molècula es va modificar químicament per incrementar la seva bioestabilitat i es va conjugar al lligand indaltralina (IND) per promoure la seva entrada en neurones aminèrgiques, sent aquest últim validat en cultius primaris de mesencèfal de rata. Finalment, l’administració intranasal de IND-SNCA499-siRNA en ratolins va disminuir específicament l’expressió α-synucleina en la SNpc, tant a nivell de mRNA com de proteïna, sense afectar la integritat de la via nigrostriatal dopaminèrgica. Aquests resultats estableixen l’escenari per estudis futurs dirigits a determinar l’efecte beneficiós d’administrar intranasalment el IND-SNCA499-siRNA en models experimentals de la MP associats amb nivells incrementats d’α-synucleina.

Parkinson’s disease (PD) is a common neurodegenerative disorder of unknown origin mainly characterized by the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) and the presence of intraneuronal proteinaceous cytoplasmic inclusions, called Lewy bodies (LB), in several affected brain areas. Although LB were identified a century ago, their significance to the pathogenic process in PD remains unknown. Mounting evidence suggest that α-synuclein, a major protein component of LB, may be responsible for initiating and spreading the pathological process in PD. Supporting this concept, intracerebral inoculation of synthetic recombinant α-synuclein fibrils can trigger α-synuclein pathology in mice. However, it remains uncertain whether the observed pathogenic effects of recombinant synthetic α-synuclein can actually apply to PD-linked human α-synuclein and occur in species closer to humans. In this thesis, we addressed this question by assessing the potential pathogenic effects of inoculating α-synuclein-containing nigral LB extracts from PD patients into the brains of wild-type mice and macaque monkeys. Nigral LB containing pathological α-synuclein were purified from post-mortem PD brains by sucrose gradient fractionation and subsequently inoculated into the SNpc or striatum of wild-type mice and macaque monkeys. In both mice and monkeys, intranigral or intrastriatal inoculations of PD-derived LB extracts resulted in progressive nigrostriatal neurodegeneration starting at striatal dopaminergic terminals. In LB-injected animals, exogenous human α-synuclein was quickly internalized within host neurons and triggered the pathological conversion of endogenous α-synuclein. At the onset of LB-induced neurodegeneration, host pathological α-synuclein diffusely accumulated within nigral neurons and anatomically interconnected brain regions. LB-induced pathogenic effects required both human α-synuclein present in LB extracts and host expression of α-synuclein. These results indicate that human α-synuclein species contained in PD-derived LB are pathogenic and have the capacity to initiate a PD-like pathological process. Further supporting a pathogenic role of α-synuclein in PD, increased levels of this protein have been described in PD patients. Therefore, molecular tools able to reverse abnormal α-synuclein expression back to physiological levels might provide therapeutic benefit in PD. Based on this hypothesis, in the second aim of this thesis we assessed the feasibility and safety of downregulating α-synuclein expression in vivo specifically in PD-vulnerable neuronal populations by intransal administration of cell-targeted small interfering RNA (siRNA) directed against α-synuclein. To achieve this goal, we performed first an in vitro screening of various siRNA sequences to select those able to downregulate basal or overexpressed α-synuclein without decreasing β- or γ-synuclein levels. Once identified, the selected molecule (SNCA499-siRNA) was then confirmed to be able to downregulate nigral α-synuclein mRNA in vivo by its local infusion in the SN of mice. This molecule was then chemically modified to enhance its biostability and conjugated to the cell-specific ligand indatraline (IND) to promote its selective delivery into aminergic neurons, the latter being validated in rat ventral midbrain primary cultures. Finally, intranasal administration of IND-SNCA499-siRNA to mice was able to selectively downregulate α-synuclein SNpc expression, both at mRNA and protein levels, without affecting the integrity of the dopaminergic nigrostriatal pathway. These results set the stage for future studies aimed at assessing the disease-modifying potential of intranasally delivered IND-SNCA499-siRNA in experimental PD models associated with increased α-synuclein levels.