Identification and evaluation of molecular biomarkers in urine for the detection of prostate cancer

Abstract

El cáncer de próstata (CP) es una de las mayores causas de muerte entre los hombres de los países desarrollados. Sin embargo, los actuales métodos de diagnóstico presentan una elevada tasa de falsos positivos debido a su baja especificidad, lo que conlleva un elevado número de biopsias de próstata (BPs) practicadas innecesariamente. Además, en muchas BPs, alguna patología no cancerosa de la próstata es hallada. Una patología benigna particularmente relevante en la clínica es la Neoplasia Intraepitelial Prostática de Alto Grado (HGPIN), reconocida como el precursor más probable del CP. Cuando se descubre en una BP, se asocia con una mayor probabilidad de existencia de un CP no detectado. Por ello, estos pacientes son seguidos clínicamente durante años, incluyendo la realización de múltiples BPs de repetición. Sin embargo, sólo en una pequeña parte de los pacientes un CP será finalmente encontrado. En resumen, la gran mayoría de las BPs practicadas actualmente son innecesarias, constituyendo una molestia para el paciente y un gran gasto económico para el sistema de salud. En los últimos años se ha hecho un gran esfuerzo en la identificación de nuevos biomarcadores para el CP, con el objetivo de mejorar la situación actual. Gracias a la ubicación de la próstata en el cuerpo, en contacto directo con la uretra, células descamadas y productos secretados, incluyendo exosomas, se pueden encontrar en la orina. El objetivo principal de esta tesis es la identificación de nuevos biomarcadores en orina, con el fin de desarrollar un método no invasivo para el diagnóstico precoz y correcto de CP, tanto en pacientes referidos para una primera BP como en pacientes previamente diagnosticados con HGPIN. Los exosomas han sido propuestos como una potencial nueva fuente de biomarcadores, ya que contienen moléculas que representan sus tejidos de origen. Con el fin de identificar nuevos biomarcadores CP en exosomas urinarios, en primer lugar hemos establecido un método de aislamiento de vesículas fiable, tras lo que las vesículas obtenidas fueron caracterizadas por microscopía electrónica, Western blot y nanoparticle tracking analysis. A continuación, se realizó una fase de descubrimiento mediante LC-MS/MS label-free (n = 24). El análisis de los datos se llevó a cabo mediante medición de las intensidades iónicas, aplicando varios enfoques estadísticos con el fin de aumentar la fiabilidad de los resultados. Una vez obtenida una lista de biomarcadores candidatos, éstos fueron validados siguiendo un enfoque de la proteómica dirigida (Selected Reaction Monitoring, SRM). Finalmente, se ha identificado un perfil de 15 biomarcadores expresados diferencialmente en CP. Dos de estas proteínas, que corresponden a una subunidad alfa y una beta de integrina, fueron seleccionadas para una caracterización adicional usando modelos in vitro, debido a su interés biológico. Esta caracterización demostró la localización intracelular de estos biomarcadores en endosomas tardíos. En el contexto de las BPs de repetición por diagnóstico de HGPIN, hemos investigado una serie de biomarcadores de CP basados en ARN del sedimento urinario. Como resultado, hemos descrito tres modelos multiplex con diferentes combinaciones de los genes CDH1, PSMA, PSGR y KLK3. Todos estos modelos superan a los métodos actualmente utilizados para la detección del CP en hombres con HGPIN, y su uso en la clínica podría potencialmente ahorrar una gran cantidad de BPs de repetición innecesarias. En el futuro, los resultados derivados de este estudio podrían mejorar la actual detección del CP, distinguiendo un CP agresivo de aquel clínicamente insignificante y otras condiciones benignas y, por lo tanto, evitando el sobrediagnóstico y sobretratamiento relacionados con esta enfermedad.

Prostate cancer (PCa) is one of the leading causes of death among men in the developed countries. Nevertheless, current methods of diagnosis for PCa have a high rate of false positive results due to a low specificity and, therefore, to many unnecessary prostatic biopsies (PBs). Moreover, in many PBs a non-cancerous pathology of the prostate is found. A particularly clinically relevant benign condition is High Grade Intraepithelial Neoplasia (HGPIN), recognized as the most probable precursor to PCa. When found in PB, it is associated with an increased probability of the existence of an undetected PCa. For this reason, its encounter in a first PB guarantees an intensive surveillance over the years, including multiple repeat PBs. However, only in a small part of these patients an aggressive form of PCa will be eventually found. In summary, the great majority of the PBs practiced nowadays are unnecessary, causing pointless discomfort to the patient and extra expenses to the health care system. In the last years, a lot of effort has been put into the identification of new biomarkers for PCa that would improve the current situation. Because of the location of the prostate in the body, in direct contact with the urethra, desquamated cells and secreted products, including exosomes, can be detected in urine. The main aim of this thesis is the identification of new biomarkers for PCa in urine, in order to develop a non-invasive method for the early and accurate diagnosis of PCa, both in a first PB setting and in patients already diagnosed with HGPIN. Exosomes have been proposed as a potential new source for biomarkers, since they contain molecules representing their tissues of origin. In order to identify new PCa biomarkers in urinary exosomes, we have first established a reliable vesicles isolation method, and then the obtained vesicles were characterized by electronic microscopy, Western blot, and nanoparticle tracking analysis. Next, we carried out a discovery phase by label-free LC-MS/MS (n=24). Analysis of the data was carried out measuring the ion peak intensities and applying several different statistic approaches, in order to increase the reliability of the results. Once we had a list of biomarker candidates, these were validated following a targeted proteomics approach (Selected Reaction Monitoring, SRM). Finally, we have identified a profile of 15 differentially expressed protein biomarkers for PCa. Two of these validated proteins, corresponding to one alpha and one beta integrin subunits, were selected for further characterization using in vitro models, based on biological interest. This characterization proved the intracellular location of these protein biomarkers in late endosomes. In the context of repeat PBs due to a previous diagnosis of HGPIN, we have assayed a set of known RNA-based PCa biomarkers from urine sediment. As a result, we have described a set of three multiplex models with different combinations of the genes CDH1, PSMA, PSGR and KLK3. All these models outperform the currently existent methods for the detection of PCa in men with HGPIN, and their use in clinical practice could potentially save a high number of unnecessary repeat PBs. In the future, the results derived from this study could improve current PCa detection, distinguishing aggressive from clinically insignificant PCa and other benign conditions and, therefore, avoiding PCa related over-diagnosis and over-treatment.