Caracterización funcional de la interacción de la proteïna p53 con la ubiquitina ligasa HERC2

Abstract

Este trabajo identifica a HERC2 como una proteína que se une a p53 y modula su actividad transcripcional mediante la regulación de su oligomerización. En una primera etapa, implementamos un sistema de geles en gradiente Tris-acetato que permitió el análisis de proteínas gigantes como HERC2 y otras de menor tamaño (hasta de 10 kDa) en un solo gel de electroforesis. Después, estudiamos el papel de HERC2 en la regulación de p53, mapeando los dominios involucrados en la interacción, evaluando los niveles de expresión, actividad transcripcional, localización subcelular y oligomerización de p53 en ausencia de HERC2, para demostrar finalmente que la expresión ectópica del dominio CPH de HERC2 es suficiente para promover la oligomerización de p53 y aumentar su actividad. También se demostró que una mutación patológica de HERC2, que origina un cambio de aminoácido en la posición 594 causa la inestabilidad de la proteína, reduciendo casi por completo su expresión. Esta mutación causa una enfermedad con un fenotipo muy similar al síndrome de Angelman. Con los fibroblastos de individuos afectados por la mutación en HERC2, realizamos ensayos para estudiar la actividad transcripcional de p53 encontrándola reducida. Finalmente, demostramos que los ratones knockout para Herc2 son letales en homocigosis, demostrando que Herc2 es un gen esencial en el desarrollo embrionario de los ratones.

This work identifies HERC2 as a protein that binds to p53 and modulates its transcriptional activity by regulating its oligomerization. As a first step, we developed an electrophoretic analysis using Tris-acetate polyacrylamide gels to detect giant proteins such as HERC2 and other smaller proteins (down to 10 kDa) in the same electrophoresis gel. Then, we found that HERC2 interacted with p53 and identified the domains involved in the interaction. Also, we evaluated the levels of expression, transcriptional activity, subcellular localization and oligomerization of p53 when HERC2 was depleted, to finally demonstrate that ectopic expression of HERC2 (CPH domain) was sufficient to promote the oligomerization of p53 and increase its activity. Also, we demonstrated that a HERC2 pathological mutation, which causes an amino acid change at position 594, induced the instability of the protein and reduced its expression. This mutation causes a disease similar to Angelman syndrome. Fibroblasts affected by the mutation in HERC2 have the transcriptional activity of p53 reduced. Finally, we showed that Herc2 knockout mice are lethal in homozygous, demonstrating that Herc2 is an essential gene in the embryonic development of mice.