Caracterització de la infecció pel virus de l'hepatitis C en el marc del trasplantament hepàtic: estudi de l'expressió dels receptors d'entrada i dels antigens virals

Abstract

La present tesi doctoral està centrada en l'estudi de l'expressió dels receptors d'entrada del virus de l'hepatitis C (VHC) i la detecció dels antígens virals en mostres de fetge parafinades de pacients sotmesos a un trasplantament hepàtic (TH). La primera part de l'estudi està basada en la caracterització i anàlisi, mitjançant tècniques d'immunofluorescència i microscòpia confocal, de l'expressió dels receptors d'entrada claudina-1 (CLDN1), ocludina (OCLN) i SRB1. També s'ha dut a terme l'estudi de la cinètica viral precoç amb mostres de sèrum obtingudes abans i després del TH. Els resultats obtinguts mostren que la localització de les proteïnes CLDN1 i OCLN resta inalterable al pol apical de la cèl.lula, on colocalitzen fortament independentment de la fase de la infecció. Paral.lelament s'observa una correlació significativa entre: 1. els nivells d'SRB1 en el moment de la reperfusió del nou òrgan i la disminució de la càrrega viral (CV) a les 24h després del TH, el que suggereix l'entrada massiva del virus a l'empelt i 2. els nivells de CLDN1 i OCLN i l'increment de la CV a la setmana després del TH, el que és indicatiu de l'elevada capacitat d'adaptació i replicació del VHC.

En la segona part del treball s'analitza l'expressió dels antigens virals core i NS5A i es determina la colocalització entre abdues proteïnes i la seva distribució relativa versus les estructures cel.lulars denominades gotes lipídiques. Els resultats mostren que en un 75% de les biòpsies de fase aguda analitzades és possible detectar l'antigen core, l'expressió del qual es limita als hepatòcits. El marcatge és citoplasmàtic i granular, amb diferents graus d'intensitat. El patró de distribució de la tinció és difús, amb certa tendència a concentrar-se a les zones periportals. Existeix una correlació significativa entre el percentatge de cèl.lules core positives i: 1. l'activitat inflamatòria al lobulet i 2. els nivells de transaminasas ALT i AST. La detecció de l'expressió de la proteïna core s'associa de forma significativa amb la CV i existeix colocalització entre NS5A, core i adipofil.lina (proteïna constitutiva de les gotes lipídiques). Aquesta localització es dóna en forma d'estructures circulars, essent NS5A la proteïna que es situa majoritàriament a la part més perifèrica. Els resultats demostren per primera vegada in vivo la importància de les gotes lipídiques en la replicació i l'assamblatge del VHC.

Liver transplantation (LT) is a unique model to study the mechanisms of hepatitis C virus (HCV) entry into hepatocytes. The aims of the first study of this thesis were: 1) to characterize the expression patterns of SBR1, claudin-1 and occludin in grafts from LT recipients; 2) to explore their potential changes after infection. Our results showed that SRB1 expression was particularly abundant in the sinusoidal domain. Claudin-1 and occludin expression was restricted to the apical zone. There was a significant correlation between the amount of SRB1 at the time of reperfusion and the HCV-RNA decay during the first 24 hours following LT. Similarly, there was significant correlation between the levels of claudin-1 and occludin and the HCV-RNA increase during the first week after LT. Overall, SRB1 levels remained stable after LT, whereas claudin-1 and occludin expression increased significantly 12 months after LT, both in patients with mild and severe HCV recurrence. Despite the increase in claudin-1 and occludin levels, their expression pattern remained unchanged and restricted to the apical membrane, where claudin-1 and occludin colocalized strongly.

The aim of the second study was to detect HCV antigens in liver biopsies of these patients. All reperfusion biopsies were negative for either core or NS5A staining. NS5A and core were detected in 75% of liver biopsies obtained during the acute phase of HCV infection and in 33% of biopsies belonging to patients with active infection. Importantly, HCV antigens were not detected in any of the 11 samples from patients who cleared HCV after antiviral treatment. Single infected hepatocytes were found throughout the liver sections, with propensity to localize in the periportal areas. Immunostaining was mainly hepatocellular with a granular cytoplasmic pattern and a wide spectrum of intensity. There was strong colocalization of both proteins and in some cells the staining revealed ring-like structures, supporting the localization of core and NS5A around lipid droplets. A detailed 3D analysis showed the relative position of each protein in these structures, with core localized inside and NS5a in the periphery.