Study and development of new biosensors based on nanoparticles and nanochannels

Abstract

En el capítulo 1, se presenta una introducción general sobre el uso de nanomateriales en sistemas de biosensores electroquímicos, centrada principalmente en nanopartículas de oro y de Azul de Prusia así como en nanocanales. En este capítulo se detallan también en profundidad las aplicaciones de los sistemas basados en nanocanales de estado sólido (membranas nanoporosas).

En el capítulo 2 se detallan los objetivos generales y específicos de esta tesis.

En el capítulo 3 se muestran los resultados obtenidos sobre la síntesis y caracterización de nanopartículas de oro (20 nm) modificadas con péptidos derivados de k-caseina para su uso en el reconocimiento y cuantificación de bacterias patógenas, aprovechando sus propiedades como inhibidores de la adhesión bacteriana. En este trabajo se aprovecha la capacidad que tienen las AuNPs para actuar tanto como portadores del péptido como de marcadores electroactivos, permitiendo la evaluación de la interacción bacteria patógena-péptido de un modo simple y rápido gracias a la medición cronoamperométrica de la reacción de evolución de hidrógeno sobre electrodos serigrafiados de carbono.

En el capítulo 4 se describe el estudio de una nueva plataforma nanoporosa basada en el ensamblaje de nanoesferas, para el desarrollo de inmunosensores electroquímicos que no requieren el uso de marcadores. El sistema sensor se prepara mediante la deposición recubrimiento por inmersión, sobre la superficie de electrodos serigrafiados ITO/PET, formando una monocapa homogénea de nanoesferas de poliestireno carboxiladas. Los espacios entre las nanopartículas generan nanocanales bien ordenados, que se bloquean a través de la formación de inmunocomplejos. Las proteínas se detectan midiendo el descenso en la señal electroquímica de un indicador red-ox convencional (Fe2/3), debido al bloqueo de los nanocanales. El sistema desarrollado es simple, rápido y altamente integrado, permitiendo superar las limitaciones de sistemas basados en nanocanales propuestos anteriormente.

En el capítulo 5 se presenta un biosensor novedoso basado en el uso de nanocanales en combinación con nanopartículas de azul de Prusia como indicadores redox para la detección de proteínas biomarcadoras de cáncer, sin necesidad del uso de marcadores. La suspensión estable y homogénea de nanopartículas de azul de Prusia (4 nm) obtenidas, protegidas por polivinilpirrolidona, muestran un par de picos re-dox bien definidos y reproducibles, por lo que estas nanopartículas se aplican con éxito para la evaluación voltamperométrica del bloqueo de los nanocanales (20 nm de diámetro de poro) debido a la formación del immunocomplejo. Esta novedosa tecnología permite la captura de proteínas de bajo peso molecular dentro de los canales y su posterior detección a niveles de ng/mL, como es el caso del biomarcador de cáncer PTHrP, por sus siglas en ingles, (proteína vinculada a la hormona paratiroidea).

En el capítulo 6 se discuten las conclusiones generales de la tesis y las perspectivas futuras. Finalmente, en el contexto del desarrollo de sistemas biosensores integrados basados en nanocanales de estado sólido, en el anexo 1 se muestran los resultados preliminares relacionados con la detección in-situ de proteínas biomarcadoras secretadas por células cultivadas sobre la superficie de membranas nanoporosas. Por otro lado, en el anexo 2 se muestran los resultados preliminares relacionados con el uso de litografía de nanoimpresión para la creación de nanocanales en electrodos de ITO/PET.

A general overview about the use of nanomaterials in electrochemical biosensing, focusing on gold nanoparticles (AuNPs), Prussian blue nanoparticles (PBNPs) and nanochannels is given in Chapter 1. A special emphasis is given to the approaches based on solid-state nanochannel array devices (nanoporous membranes) including the state-of-the-art of their applications in biosensing.

The general and detailed objectives of this thesis are described in Chapter 2.

Chapter 3 presents the results obtained for the synthesis and characterization of gold nanoparticles (AuNPs 20 nm sized) modified with k-casein derived peptides for the fimbriae bacteria recognition and quantification, taking advantage of the peptide effect as bacterial adhesion inhibitor. This peptide-based nanoparticle assay takes advantage of the dual character of the AuNPs: as carrier of the biorecognition molecule and as electrocatalytic label, allowing the evaluation of the pathogen bacteria-peptide interaction in a simple and rapid way through the chronoamperometric monitoring of the hydrogen evolution reaction (HER) on screen-printed carbon electrodes.

Chapter 4 describes the study of a novel, cheap, disposable and single-use assembled nanoparticles-based nanochannel platform for label-free immunosensing. This sensing device is based on the deposition of a homogeneous monolayer of carboxylated polystyrene nanospheres onto the working area of homemade screen-printed ITO/PET electrodes by dip-coating. The spaces between the self-assembled nanospheres generate well-ordered nanochannels, which are blocked upon the immunocomplex formation. Proteins are detected through the monitoring of the blockage in the channels, which is evaluated by the decrease in the voltammetric signal of a typical red-ox indicator. The developed device represents an integrated and simple biodetection system which overcomes many of the limitations of previously reported nanochannels-based approaches representing a really disposable biosensing device for a one-step sensing application. The work described in this chapter is done in collaboration with EMPA (Swiss Federal Laboratories for Materials Science and Technology).

The development and study of a novel nanochannel array device, that operates through Prussian blue nanoparticles (PBNPs) as red-ox indicator for sensitive label free immunodetection of a cancer biomarker is presented in Chapter 5. Stable and narrow-sized (around 4 nm) PBNPs, protected by polyvinylpyrrolidone, exhibit a well-defined and reproducible red-ox behavior and are successfully applied for the voltammetric evaluation of the nanochannels (20 nm pore sized) blockage due to the immunocomplex formation. This novel and effective technology for the detection of small proteins captured inside the nanochannels is successfully applied for the quantification of a cancer biomarker (parathyroid hormone-related protein, PTHrP). In Chapter 6 the general conclusions and the future perspectives are discussed Finally, in the context of the development of nanochannel array-based integrated systems, Annex 1 describes the preliminary results related to the use of nanoimprint lithography (NIL) for the nanochannels creation onto ITO/PET electrodes. In addition, Annex 2 describes preliminary studies related to the in-situ detection of protein biomarkers secreted by cells cultured onto nanoporous membranes.