Study of Cucumber mosaic virus infection in the resistant melon accession PI 161375

Abstract

L’accessió exòtica de meló PI 161375 presenta una barreja de resistència qualitativa i quantitativa front a la infecció per CMV depenent de la soca. Anteriorment s’ha descrit la presencia del gen recessiu de resistència cmv1 situat en el grup de lligament XII, i que conferia resistència total només a algunes soques de CMV (Essafi et al., 2009). En aquesta tesi hem ampliat els coneixements sobre la resistència determinada pel gen cmv1 present en meló i hem obtingut la seqüència i els clons infectius de la soca M6. Aquesta tesi ha estat estructurada en tres capítols. En el primer capítol vam analitzar la resistència conferida pel gen cmv1 en 11 soques de CMV del subgrup I i II. Els resultats van indicar que cmv1 conferia resistència total a les soques del subgrup II però no a les del subgrup I. Mitjançant l’ús dels clons infectius de les soques CMV-LS (subgrup II) i CMV-FNY (subgrup I) vam fer combinacions entre els RNAs d’ambdues soques podent localitzar el determinant de virulència en el RNA3. Virus quimèrics entre FNY i LS van indicar-nos que el determinant de virulència estava en els 209 aminoàcids de l’extrem N-terminal de la proteïna de moviment. Mitjançant mutagènesi dirigida vàrem identificar una combinació de 4 posicions específiques que confereixen a LS l’habilitat de sobrepassar la resistència conferida pel gen cmv1 quan els substituïm pels residus corresponents de la soca FNY. El segon capítol tracta de la caracterització de la resistència conferida pel gen cmv1. La soca CMV-LS és capaç de replicar-se i de moure’s cèl·lula a cèl·lula en la fulla inoculada de la línia resistent. No obstant, LS és incapaç d’envair el floema ja que no hem pogut detectar virus en el floema de la línia resistent. Mitjançant immunomarcatge de CMV amb or col·loïdal hem identificat el límit entre cèl·lules de la beina (BS) i parènquima vascular (VP) o cèl·lules acompanyants (IC) com a barrera que impedeix la infecció sistèmica en la línia portadora del gen cmv1. Amb els resultats obtinguts hem demostrat que la resistència determinada pel gen cmv1 interromp l’entrada del virus al sistema vascular, impedint així una infecció sistèmica. En el tercer capítol vam obtenir la seqüència de la soca CMV-M6 i vam generar clons moleculars capaços d’infectar sistèmicament N. benthamiana i meló.

La accesión exótica de melón PI 161375 presenta una mezcla de resistencia cualitativa y cuantitativa frente a la infección por CMV, dependiendo de la cepa. Anteriormente se describió en nuestro laboratorio la presencia del gen recesivo de resistencia cmv1 situado en el grupo de ligamiento XII, y que confería resistencia total sólo a algunas cepas de CMV (Essafi et al., 2009). En esta tesis hemos ampliado los conocimientos sobre la resistencia mediada por el gen cmv1 presente en melón y hemos obtenido la secuencia y los clones infectivos de la cepa M6. La tesis ha sido estructurada en tres capítulos. En el primer capítulo analizamos la resistencia conferida por el gen cmv1 en 11 cepas de CMV del subgrupo I y II. Los resultados indicaron que cmv1 confería resistencia total a las cepas del subgrupo II pero no a las del subgrupo I. Mediante el uso de los clones infecciosos de las cepas CMV-LS (subgrupo II) y CMV-FNY (subgrupo I) hicimos combinaciones entre los RNAs de ambas cepas, pudiendo localizar el determinante de virulencia en el RNA3. Quimeras entre FNY y LS indicaron que el determinante de virulencia estaba en los 209 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína de movimiento (MP). Mediante mutagénesis dirigida identificamos una combinación de 4 posiciones específicas que confieren a LS la habilidad de sobrepasar la resistencia mediada por cmv1 cuando las sustituimos por los residuos correspondientes de la cepa FNY. El segundo capítulo trata de la caracterización de la resistencia conferida por el gen cmv1. La cepa CMV-LS es capaz de replicarse y moverse célula a célula en la hoja inoculada de la línea resistente. No obstante, LS es incapaz de invadir el floema ya que no hemos podido detectar virus en el floema de la línea resistente. Mediante inmunomarcaje de CMV con oro coloidal hemos identificado el límite entre células de la vaina (BS) y parénquima vascular (VP) o células acompañantes (IC) como barrera que impide la infección sistémica en la línea portadora del gen cmv1. Con los resultados obtenidos hemos demostrado que la resistencia determinada por el gen cmv1 interrumpe la entrada del virus al sistema vascular, impidiendo así una infección sistémica. En el tercer capítulo hemos obtenido la secuencia de la cepa CMV-M6 y generado clones moleculares capaces de infectar sistémicamente N. benthamiana y melón.

The exotic melon accession PI 161375 shows a complex mixture of qualitative and quantitative resistance to Cucumber mosaic virus (CMV) infection, depending on the strain. Previously, the presence of a recessive gene (cmv1) in the linkage group XII conferring total resistance to a set of CMV strains was reported in our laboratory (Essafi et al., 2009). In this thesis we have extended the knowledge about the cmv1-mediated resistance present in melon and have obtained the sequence of the strain CMV-M6 and its infectious clones. This thesis is divided in three chapters. In the first chapter, we have analysed the cmv1-mediated resistance in 11 strains of CMV from subgroup I and II and have established that cmv1 confers total resistance only to strains of subgroup II. Using infectious clones of strains CMV-LS (subgroup II) and CMV-FNY (subgroup I) we have made combinations between RNAs of both strains showing that the determinant of the virulence is located in RNA3. Chimaeras between CMV-FNY and CMV-LS showed that the determinant of virulence is in the N-terminal 209 amino acids of the movement protein (MP). By directed mutagenesis, we identified a combination of four specific positions that confer to LS the ability to overcome cmv1-mediated resistance when exchanged for the corresponding FNY residues. In the second chapter, we have characterized the resistance mediated by cmv1. The strain CMV-LS is able to replicate and move cell to cell in the inoculated leaf of the resistant line. However, it is not able to invade the sieve elements since it has not been detected in the phloem of the resistant line. By immunogold labelling of CMV particles we have identified that the boundary between bundle sheath cells (BS) and vascular parenchyma (VP) or intermediary cells (IC) impedes the systemic infection in the resistant line. Altogether, our results demonstrate that the resistance determined by cmv1 involves interruption of the virus entry into the vascular system and therefore, inability to develop a systemic infection. In the third chapter, we have obtained the sequence of CMV-M6 strain and generated infectious clones able to infect systemically N. benthamiana and melon.