Caracterització del quorum sensing regulat per les N-acil-L-homoserina lactonas en Stenotrophomonas maltophilia

Abstract

Els senyals de quorum sensing (QS) del tipus N-acil-L-homoserina lactonas (AHLs) són les molècules predominants detectades entre els proteobacteris. En el sistema de QS regulat per les AHLs intervenen dues proteïnes que pertanyen a la família del tipus LuxI i LuxR. Les proteïnes LuxI sintetitzen AHLs que interactuen amb un domini específic de les proteïnes LuxR. Aquest complex s’uneix a seqüències promotores específiques i permeten a la població bacteriana coordinar l’expressió gènica. En molts bacteris gram negatius, aquest sistema regula factors de virulència. L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la identificació i caracterització de les molècules senyal del tipus AHLs i determinar diferents fenotips associats al QS mitjançant l’estudi del regulador del sistema (luxR) en Stenotrophomonas maltophilia, un patogen humà oportunista intrahospitalari emergent. Així, l’estudi s’ha centrat en primer terme en la detecció d'AHLs en diferents aïllats clínics d’aquest patogen, en concret de les soques E77, M30 i K279a. La detecció d'AHLs s’ha dut a terme emprant la soca biosensora d’Agrobacterium tumefaciens KYC55 i, posteriorment, les AHLs s’han caracteritzat per espectrometria de masses. S’ha fet també un estudi del promotor del gen luxR, que ha permès identificar que l’expressió d’aquest gen és depenent de la fase de creixement. A més a més, s’ha demostrat que el domini d’unió a AHLs del regulador LuxR és capaç d’unir-se a aquestes molècules senyal. A nivell fenotípic s’ha investigat la implicació de LuxR en la formació de biofilms i en la motilitat del tipus swarming. Els resultats han demostrat la influència de LuxR en els dos fenotips tal i com s’ha descrit per altres LuxR homòlegs. Tanmateix, s’ha apreciat la inhibició d’ambdós processos quan s’ha usat com a inhibidor de QS (IQS) l’enzim AiiA, procedent de Bacillus subtilis, el qual hidrolitza les AHLs. Per últim, s’ha posat de manifest l’efecte estimulant que exerceix el sobrenedant de P. aeruginosa MPAO1 sobre el swarming de S. maltophilia. El fet d’haver estat capaços d’identificar i caracteritzar les AHLs i el regulador d’aquest sistema (LuxR), ens ha dut a cercar la sintasa (LuxI) entre els diferents genomes publicats. Tot i així, l’aproximació utilitzada en aquest treball no ens ha permès determinar la proteïna LuxI i, per tant, continua sent un objectiu obert que caldrà resoldre. Fins a dia d’avui, només el sistema de QS regulat per la molècula senyal anomenada Diffusible signal factor (DSF), ha estat ben estudiat en aquesta espècie. Els resultats obtinguts evidencien que en S. maltophilia podrien coexistir diferents sistemes de comunicació, un mediat pel DSF i un segon per les AHLs.

The N-acil-L-homoserine lactones (AHLs) signals are the predominant quorum sensing (QS) molecules detected among proteobacteria. A typical QS system is commonly mediated by two proteins belonging to LuxI and LuxR protein family. LuxI-type proteins synthesize AHLs which interact with a specific domain of LuxR-type proteins. This complex binds specific promoter sequences and allows bacterial populations to coordinate gene expression. In many gram-negative bacteria, this system regulates virulence factors. The main objectives of this work are the identification and characterization of signaling molecules (AHLs) and the determination of different QS phenotypes associated with the regulator of this system (luxR), in the emergent nosocomial opportunistic human pathogen Stenotrophomonas maltophilia. The study is firstly focused on the detection of AHLs in different clinical isolates of this pathogen, in particular in E77, M30 and K279a strains. The detection of AHLs was carried out using Agrobacterium tumefaciens KYC55 biosensor strain and posterior characterization of these molecules by mass spectrometry analysis. On the other hand, the study of luxR promoter allowed determining a growth-phase regulation of luxR gene expression. It has also been shown that the AHL binding domain of LuxR can bind these AHLs molecules. At phenotype level, the role of LuxR as a regulator has been analyzed through biofilm formation and swarming motility. The results demonstrate the influence of LuxR in both phenotypes, as described for other LuxR homologues. Furthermore, inhibition of QS by B. subtilis, AiiA enzyme, which hydrolyzes AHLs, caused the inhibition of biofilm formation and swarming motility. Finally, the stimulant effect produced by the supernatant of P. aeruginosa on swarming motility of S. maltophilia has been described. The fact of being able to identify and characterize the signal molecules (AHLs) and the regulator of the system (LuxR), lead us to look for the synthase (LuxI) among the annotated genomes. However, our first tentative did not allow us to determine LuxI, and because of that, this goal still remains to be clarified. Up to date, the QS system regulated by the signal molecule called Diffusible signal factor (DSF), is the only one that has been well studied in this species. The results obtained show that in S. maltophilia could coexist two different chemical language: one mediated by DSF and a second one by AHLs