Estudi de la relació estructura-funció de les metal·lotioneïnes en sistemes polimòrfics d’animals (eriçó de mar) i de plantes (soja i gira-sol)

Abstract

Les metal·lotioneïnes (MT) constitueixen una superfamília de metal·loproteïnes de baix pes molecular que es caracteritzen pel seu elevat contingut en residus Cys, els quals els confereixen les seues propietats coordinants i reductores. És com a conseqüència d’aquestes propietats que se’ls atribueixen funcions d’homeòstasi i destoxicació de metalls, així com de regulació i protecció en processos redox. Les MT són ubíqües i les seues seqüències són molt diverses. En la present Tesi Doctoral hem tractat d’ampliar els coneixements actuals sobre aquestes metal·loproteïnes i aprofundir en la seua relació estructura-funció. Així, d’una banda s’han analitzat les preferències metàl·liques envers metalls mono- i divalents de les dues isoformes de MT presents en l’eriçó de mar (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA i SpMTB, les quals presenten patrons de Cys alineables. S’ha determinat que SpMTA mostra millors habilitats per a coordinar Zn(II) i Cd(II) que SpMTB i que, en canvi, SpMTB mostra millors propietats per a coordinar Cu(I) que SpMTA. Aquestes preferències metàl·liques s’han relacionat amb una diferenciació funcional en l’organisme. D’altra banda, s’han estudiat els sistemes MT de les plantes de soja (Glycine max) i gira-sol (Helianthus annuus), les quals s’ha vist que sintetitzen representants de les quatre subfamílies en què es divideix la família de les MT de planta, que presenten patrons de Cys no alineables. Així, s’ha determinat que les MT1 i MT2 de gira-sol estudiades (HaMT1 i HaMT2) presenten una major capacitat de coordinació de Cd(II) que les MT1 i MT2 de soja (GmMT1 i GmMT2), probablement a causa del seu major contingut en Cys. A més, s’ha vist que les His C-terminals que ambdues MT3 (GmMT3 i HaMT3) contenen i que es troben semiconservades en la subfamília participen en l’enllaç al Cd(II). MT4 de soja (GmMT4) presenta la mutació natural His54Tyr que trenca amb el patró de Cys i His conservat en la subfamília MT4, la qual s’ha demostrat que suposa una disminució en la capacitat de coordinació de Zn(II). En canvi, tant GmMT4 com MT4 de gira-sol (HaMT4), que presenta el patró típic de Cys i His, presenten capacitats de coordinació de Cd(II) anàlogues, donat que cap de les seues His no participa en l’enllaç al Cd(II). A més, l’estudi de capacitats antioxidants i/o de captadors de radicals lliures de les quatre MT de soja ha permés proposar que la llargària de l’espaiador (regió lliure de Cys) és determinant per a la protecció enfront de l’oxidació de les Cys provocada per l’exposició a peròxid d’hidrogen, així com que Zn-GmMT1 és el complex que ha mostrat les millors propietats per a protegir les cèl·lules davant l’atac de les espècies reactives d’oxigen.

Metallothioneins (MT) constitute a low molecular weight metalloprotein superfamily characterised by their high Cys residue content, which confers them their coordinative and reducing properties. As a result of these properties, MTs are proposed to be involved in homeostasis and metal detoxification functions, as well as in regulation and protection during redox processes. MTs are ubiquitous and their sequences are extremely variable. In this PhD Thesis we have tried to expand the current knowledge about these metalloproteins and to deepen into their structure-function relationship. Thus, on the one hand, the metallic preferences towards mono- and divalent metal ions of the two MT isoforms present in sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA and SpMTB, which display alignable Cys patterns, have been analysed. It has been determined that SpMTA shows better Zn(II)- and Cd(II)-binding abilities than SpMTB, and that, on the contrary, SpMTB shows better Cu(I)-binding abilitites than SpMTA. These metallic preferences have been related to a functional differentiation within the organism. On the other hand, the MT systems from the soybean (Glycine max) and sunflower (Helianthus annuus) plants have been studied, which have been proven to synthesise representatives of the four subfamilies in which the plant MT family is divided, and that show non-alignable Cys patterns. Thus, it has been shown that sunflower MT1 and MT2 (HaMT1 and HaMT2) display a greater Cd(II)-binding capacity than MT1 and MT2 from soybean (GmMT1 and GmMT2), probably due to their higher Cys content. In addition, it has been shown that the C-terminal His present in both MT3 (GmMT3 and HaMT3), which are semiconserved within this subfamily, are involved in Cd(II) coordination. Soybean MT4 (GmMT4) presents the natural His54Tyr mutation that breaks the highly conserved Cys and His pattern in MT4 subfamily, which has been shown to provoke a decrease in its Zn(II)-binding capacity. However, both GmMT4 and sunflower MT4 (HaMT4), which presents the typical MT4 Cys and His pattern, show analogous Cd(II) coordination capacities, since none of their His are involved in Cd(II) binding. In addition, the study of the antioxidant and/or free radicals scavenging capacities of the four soybean MTs has allowed to propose that the length of the spacer (Cys-free region) is crucial to protect Cys from the oxidation caused by hydrogen peroxide exposure, and that the Zn-GmMT1 complex has been the best suited to protect the cells against the attack by reactive oxygen species.