Characterization of the fas death receptor antagonist in the nervous system, lifeguard (LFG)

Abstract

La activación del Receptor de Muerte Fas, también llamado APO-1 o CD95, da lugar a la formación del Death Inducing Signaling Complex (DISC). Este complejo proteico contiene FADD y caspasa-8, entre otras proteínas, y causa el corte y activación de caspasa-8, que finalmente da lugar a la apoptosis. Existen dos vías de señalización diferenciadas en la apoptosis inducida por Fas. En las células tipo I, la activación de Fas da lugar a la formación de altos niveles de DISC, y los niveles de caspasa-8 son suficientes para cortar directamente la caspasa-3 ejecutora, que desencadena la apoptosis. En las células tipo II, los niveles de formación de DISC son más bajos y caspasa-3 no es cortada directamente por caspasa-8. En vez de ello, caspasa-8 corta la proteína BH3- only Bid, dando lugar a su forma truncada tBid, que transloca a la mitocondria e induce su permeabilización. Esto conlleva la salida de factores apoptogénicos de la mitocondria al citosol, como citocromo c, que da lugar a la activación de caspasa-3 a través del apoptosoma. Así, las células tipo II necesitan un paso de amplificación de la señal a través de la mitocondria. Los Antagonistas de los Receptores de Muerte son proteínas que son capaces de modular la actividad de los Receptores de Muerte. Entre ellos, Lifeguard (LFG), también llamado NMP35 o FAIM2, es un antagonista de Fas altamente expresado en el sistema nervioso. Esta proteína ha sido caracterizada como un inhibidor de la apoptosis inducida por Fas, y se ha comprobado su localización en los sitios postsinápticos y en las dendritas. Además, se ha comprobado que interacciona directamente con el receptor Fas en los rafts, e inhibe la actividad de las caspasas-8 y -3 tras la activación de Fas. Sin embargo, su mecanismo de acción aún no ha sido descrito. En este trabajo tratamos de arrojar algo de luz sobre este problema. Primero, resultados previos en nuestro laboratorio mostraron que LFG interacciona con varias proteínas del sistema ubiquitina. Confirmamos que LFG está ubiquitinado, y también mostramos que esta ubiquitinización no induce su degradación. Además, nuestros resultados sugieren que la ubiquitinización de LFG es no-canónica. Por otro lado, llevamos a cabo un extenso estudio para elucidar la localización subcelular de LFG. Demostramos que LFG localiza en las membranas del RE y del Golgi, y en menor medida, también en los endosomas. Dado que LFG es miembro de la familia de proteínas TMBIM, que son capaces de modular la actividad de las proteínas de la familia Bcl-2, investigamos su relación con ellas, y encontramos que interacciona con Bcl-xL y Bcl-2 a través de su región C-terminal. Además, demostramos que LFG solamente protege a las células tipo II de la muerte inducida por Fas, y esta protección es dependiente de la expresión endógena de Bcl-xL. Para finalizar, nuestros resultados revelan un paso no descrito hasta el momento en la vía de señalización de las células tipo II. La movilización de calcio del RE se ha comprobado que es relevante en la vía de señalización apoptótica inducida por Fas. Aquí, demostramos que LFG modula la salida de calcio del RE tras la estimulación de Fas, e inhibe la apoptosis inducida por Fas en células tipo II. Basándonos en estas observaciones, proponemos que LFG protege de la apoptosis inducida por Fas mediante la modulación de la salida de calcio del RE.

Activation of the Death Receptor Fas, also called APO-1 or CD95, leads to the formation of the Death Inducing Signaling Complex (DISC). This protein complex comprises FADD and caspase-8, among other proteins, and it causes the cleavage and activation of caspase-8, that ultimately leads to apoptosis. There are two differentiated pathways in the Fas induced apoptosis. In type I cells, high levels of DISC are formed upon Fas activation, and caspase-8 levels are sufficient to directly cleave the effector caspase-3, which will trigger apoptosis. In type II cells, DISC formation levels are lower and caspase-3 is not directly cleaved by caspase-8. Instead, caspase-8 cleaves the BH3-only protein Bid, generating its truncated form tBid, which translocates to the mitochondria and induce its permeabilization. This will result in release of apoptogenic factors from the mitochondria to the cytosol, such as cytochrome c, which will activate caspase-3 through the apoptosome. Thus, type II cells need a signal amplification step through the mitochondria. Death Receptor Antagonists are proteins that are able to modulate Death Receptor activity. Among them, Lifeguard (LFG), also called NMP35 or FAIM2, is a Fas antagonist highly expressed in the nervous system. This protein has been characterized as a Fas-induced apoptosis inhibitor, and it has been shown that localizes at postsynaptic sites and dendrites. Moreover, it has been reported to interact directly with Fas receptor in the lipid rafts and inhibit caspase-8 and caspase-3 activity upon Fas activation. However, its mechanism of action has remained elusive. In this work, we try to shed some light on this problem. First, previous results in our lab have shown that LFG interacts with several proteins from the ubiquitin system. We confirmed that LFG is ubiquitinated, and we also show that this ubiquitination does not induce its degradation. In addition, we present data that suggest that LFG ubiquitination is done in a non-canonycal way. On the other hand, we make an extensive study to elucidate LFG subcellular localization. We demonstrate that LFG localizes to ER and Golgi membranes, and to a lesser extent, to endosomes. Since LFG is member of the TMBIM family proteins, that are able to modulate Bcl-2 family activity, we investigated its relationship with them, and found that it interacts with Bcl-xL and Bcl-2, through its C-terminal region. Moreover, we prove that LFG protects only type II cells from Fasinduced apoptosis, and this protection is dependant on Bcl-xL endogenous expression. Finally, our results reveal a hitherto undescribed step in the signaling pathway in type II cells. Calcium mobilization from the ER has been shown to be relevant in Fas apoptotic signaling. We demonstrate that LFG modulates calcium release from the ER after Fas stimulation and inhibits Fasinduced apoptosis in type II cells. On the basis of our observations, we propose that LFG protects against Fas-induced apoptosis by modulating calcium release from the ER.