Caracterización molecular de los genes blaAmpC cromosómicos y adquiridos en aislados clínicos de Escherichia coli en el área de Barcelona

Abstract

Escherichia coli presenta un gen blaAmpC cromosómico que se expresa de forma constitutiva a bajo nivel debido a la presencia de un promotor débil y un atenuador. En estas condiciones no confiere resistencia a betalactámicos. Sin embargo, E. coli puede incrementar la expresión de este gen debido a mutaciones en su región promotora/atenuadora (AmpCc) o adquirir genes blaAmpC incluyendo CMY, DHA, ACC, FOX, MOX, ACT, MIR, LAT y CFE (AmpCa), mecanismos que confieren resistencia a penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas y aztreonam. A diferencia de lo que sucede con las betalactamasas de espectro extendido (BLEE), la detección fenotípica de betalactamasas AmpC es difícil debido a la escasez de métodos estandarizados. Los estudios sobre la epidemiología y las características clínicas asociadas con infecciones producidas por E. coli productora de AmpC son limitados. Además, en las cepas productoras de AmpC es frecuente la corresistencia a otras familias de antimicrobianos, lo que convierte el tratamiento de estas infecciones en un reto para el clínico. Se realizó un estudio multicéntrico con el Consorci Sanitari de Terrassa, el Hospital Universitario Mútua de Terrassa y el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona, en el que se analizaron los aislados de E.coli con patrón fenotípico compatible con la producción de AmpC entre junio de 2010 y noviembre de 2011. El objetivo de este estudio fue conocer la prevalencia de aislados productores de AmpC, identificar los genes blaAmpC adquiridos, así como las mutaciones involucradas en la hiperproducción del gen blaAmpC cromosómico, además de conocer la estructura de la población y sus resistencias asociadas. De un total de 240 cepas analizadas, el 75% eran portadoras de AmpCa, siendo CMY-2 el enzima mayoritario, seguido de DHA-1. El 25% restante resultaron ser hiperproductoras de su AmpCc, cuyo principal mecanismo fue la presencia de mutaciones que daban lugar a un promotor alternativo desplazado. Ello provocaba un incremento medio de la expresión del gen ampC de 72,5. También se encontraron otros dos patrones de mutaciones que originaban modificaciones en la región espaciadora del promotor o alteraciones en el atenuador, con incrementos medios de la expresión de 19,9 y 5,8, respectivamente. El análisis de los grupos filogenéticos permitió conocer la estructura de la población estudiada. Se observó que un 60% de los aislados con AmpCa pertenecían a los grupos filogenéticos B2, D, E o F. Un 82% de los aislados hiperproductores con un promotor desplazado pertenecían a los grupos A, B1 o C. Todos los aislados con la región atenuadora modificada y un 67% de los aislados con la región espaciadora modificada pertenecían a los grupos B2, D, E o F. De la misma manera que ocurre con las cepas portadoras de BLEE, los plásmidos que vehiculan los genes blaAmpC suelen contener otros genes que confieren resistencia a otras familias de antibióticos. El estudio de la sensibilidad mostró tasas de resistencia a ácido nalidíxico, estreptomicina, ciprofloxacino y cotrimoxazol de 79%, 62%, 57,5% y 44%, respectivamente. Se observó que el 30% y 11% de los aislados con AmpCa y AmpCc, respectivamente, eran portadores de determinantes PMQR (plasmid-mediated quinolone resistance). Entre los PMQR detectados en aislados con AmpCa el mayoritario fue qnrB4, siempre en cepas portadoras de blaDHA-1, seguido de aac(6’)-Ib-cr. En aislados hiperproductores de AmpCc el PMQR mayoritario fue aac(6’)-Ib-cr. El continuo aumento de la prevalencia de estos enzimas se debe principalmente a la diseminación de los genes blaAmpC por transferencia horizontal. En los plásmidos analizados IncI1 e IncF fueron los replicones mayoritarios asociados a blaCMY-2 y blaDHA-1, respectivamente. El análisis de la estructura poblacional de los plásmidos mediante pMLST determinó que existía una gran variabilidad genética entre ellos. IncI1/ST12 fue la secuencia tipo mayoritaria. También se encontraron IncI1/ST26, IncI1/ST55, IncI1/ST94 e IncI1/ST134, siendo este último descrito por primera vez en este estudio. De los plásmidos incluidos en el grupo IncF, cada uno correspondía a una secuencia tipo diferente.

Escherichia coli has a chromosomal blaAmpC gene that is expressed constitutively at low level due to the presence of a weak promoter and an attenuator. Under these conditions, this gene does not confer resistance to beta-lactams. However, this chromosomal gene may be overproduced due to mutations in the promoter/attenuator region (cAmpC). Additionally, E. coli may also acquire blaAmpC genes (aAmpC), namely CMY, DHA, ACC, FOX, MOX, ACT, MIR, LAT and CFE. Both mechanisms (cAmpC and aAmpC) confer resistance to penicillins, cephalosporins, cephamycins and aztreonam. In contrast to the range of phenotypic methods available for extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs), no standardized methods are available to detect AmpC beta-lactamases. There is a paucity of reports on the epidemiology and clinical features associated with infections caused by AmpC-producing E. coli. Furthermore, these isolates frequently present co-resistance to other families of antibiotics, converting treatment of these infections into a clinical challenge. A multicentric study was performed to analyse E. coli isolates with a resistance pattern compatible with the production of AmpC. Isolates were obtained from Consorci Sanitari de Terrassa, Hospital Universitario Mútua de Terrassa and Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Barcelona, Spain) between June 2010 and November 2011. The aims of this study were: 1) to determine the prevalence of AmpC-producing E. coli isolates; 2), to identify acquired blaAmpC genes and the mutations involved in the overproduction of the chromosomal blaAmpC gene; and 3) to describe the population structure and patterns of resistance. A total of 240 strains were analysed. Of these, 75% were aAmpC-carriers and the remaining were cAmpC-overproducers. CMY-2 was the predominant enzyme, followed by DHA-1. Most cAmpC-overproducers had mutations that yielded an alternate displaced promoter and caused an increase of blaAmpC expression (average increase of expression 72.5). Two other different mutational patterns were found: a modified spacer region in the promoter and a modified attenuator (the average increase of expression was 19.9 and 5.8, respectively). Analysis of the phylogenetic groups allowed to gain knowledge of the population structure. Of all aAmpC isolates, 60% belonged to the phylogenetic groups B2, D, E and F. Among cAmpC overproducers, 82% of the isolates bearing a displaced promoter belonged to groups A, B1 and C. All the isolates with modified attenuator regions and 67% of the isolates with modified spacer regions belonged to groups B2, D, E and F.

As it happens in ESBL-carrying strains, the plasmids carrying blaAmpC genes may also carry other genes, conferring resistance to other families of antibiotics. In the present study, the percentage of resistance to nalidixic acid, streptomycin, ciprofloxacin and trimethoprim-sulfamethoxazole was 79%, 62%, 57.5% and 44%, respectively. Plasmid-mediated quinolone resistance determinants (PMQR) were detected in 30% of the aAmpC isolates and 11% of the cAmpC isolates. Among aAmpC isolates, the most predominant PMQR was qnrB4 (always in blaDHA-1 carriers), followed by aac(6’)-Ib-cr. Among cAmpC isolates, the predominant PMQR was aac(6’)-Ib-cr. The increase in the prevalence of these enzymes is due to the spread of genes through horizontal transfer. The analysis of plasmids showed that IncI1 and IncF were the main replicons involved. IncI1 and IncF were related to blaCMY-2 and blaDHA-1, respectively. The pMLST analysis of plasmids revealed a large genetic variability. IncI1/ST12 was the predominant sequence type. Other sequence types belonging to the same incompatibility group were IncI1/ST26, IncI1/ST55, IncI1/ST94 and IncI1/ST134, the latter being first described in this study. Regarding IncF, each plasmid corresponded to a different sequence type.