Anàlisi funcional de dominis de proteïnes implicades en la motilitat de Mycoplasma genitalium

Abstract

Mycoplasma genitalium és un patogen emergent de transmissió sexual. Aquest microorganisme sense paret cel·lular conté un dels genoma més petit que es coneix entre els organismes autoreplicatius i això el converteix en un model atractiu de cèl·lula mínima. Tot i l’aparent simplicitat, M. genitalium presenta un complex citoesquelet intern que polaritza la cèl·lula i li atorga la característica forma de pera, deguda a la formació d’un apèndix a un extrem de la mateixa. Aquest apèndix es coneix com organela terminal (OT) i està implicat en processos clau de la seva vida parasitària. L’OT té un paper central en la motilitat per lliscament del micoplasma. Aquest mecanisme únic i encara poc caracteritzat està relacionat amb molts aspectes de la seva biologia, amb especial rellevància en la patogènesi. L'objectiu general d'aquest treball és aprofundir en la comprensió d'aquest mecanisme mitjançant l'estudi de la contribució específica de diferents dominis de proteïnes prèviament relacionats amb l'OT o la motilitat. L’OT s'organitza al voltant del citoesquelet intern. La proteïna MG218 és un dels elements principals del citoesquelet i té un paper central en la formació de l’OT. Recentment, s’ha identificat una nova proteïna que comparteix la seqüència C-terminal de MG218. Aquesta proteïna (MG218-s) és producte d’una traducció interna del gen MG218 però el seu inici de traducció exacte encara no està definit. Per entendre millor la funció d'aquesta proteïna, en el primer capítol, s’ha dissenyat una nova estratègia per introduir mutacions puntuals en el genoma de M. genitalium. Aquesta estratègia ha permès la identificació de la Met inicial de la proteïna MG218-s i s’ha obtingut i caracteritzat un mutant defectiu en MG218-s, però que segueix expressant la proteïna MG218. El segon i tercer capítol se centren en l'estudi de la proteïna MG200, que és un element important de la maquinària de la motilitat. Les proteïnes MG200 i MG386 són els primers elements que s’han relacionat exclusivament amb la motilitat de M. genitalium. Aquestes proteïnes comparteixen diferents característiques, essent destacable la presència d'un domini ric en glicina i residus aromàtics (caixa EAGR), que es troba exclusivament en micoplasmes, aparentment sempre en proteïnes relacionades amb la motilitat i/o l'arquitectura de l’OT, com la MG312. L'anàlisi de l'estructura cristal·lina del domini de la caixa EAGR de MG200 suggereix un rol en interaccions proteïna-proteïna, on aquest domini podria servir de plataforma per interaccions macromoleculars. Ara bé, no s’han descrit defectes estructurals en l’OT de cèl·lules mutants amb delecions en proteïnes que contenen caixes EAGR. Per comprendre millor el paper d'aquest domini, en el segon capítol s'analitza el fenotip de mutants que expressen la proteïna MG200ΔE, que té delecionat específicament el domini de la caixa EAGR. És interessant que la MG200 és una proteïna multidomini amb homologia amb co-xaperones Hsp40. La interrupció del locus MG_200 per la inserció de transposó dóna lloc a mutants adherents amb un fenotip no mòtil. Una anàlisi recent d'aquests mutants ha evidenciat la presència d'un fragment animo-terminal de MG200, que conté un domini J i una regió rica en glicina i fenilalanina característics de les proteïnes DnaJ. En el tercer capítol, s'ha estudiat la contribució d’aquests dominis amino-terminals de MG200 en la funció general de la proteïna.

Mycoplasma genitalium is an emerging sexually transmitted pathogen. This wall-less microorganism is among the smallest, self-replicating cell known. Its streamlined genome is an appealing model of a minimal cell. Behind this apparent simplicity, its cell membrane hides a complex cytoskeleton that shapes and polarizes the cell. In this way, cells show a differentiated tip structure, known as terminal organelle (TO), which is involved in key processes of its parasitic way of life. Moreover, TO is involved in gliding motility. This unique motility mechanism is related in many aspects of the biology of this microorganism, with especial relevance in pathogenesis. Nevertheless, the mechanics behind it is still poorly characterized. The general aim of the present work is to deepen the understanding of this mechanism by studying the specific contribution of different domains of proteins previously related with the TO or motility. TO is organized around an internal cytoskeletal structure. MG218 protein is one of the main proteins of the cytoskeleton and has a central role in the TO formation. Recently, a novel protein that shares the C-terminal sequence of MG218 has been identified. This new protein (MG218-s) is translated from a specific mRNA transcribed from a promoter located inside mg218 gene but the precise translation start remains undefined. To gain insight into the function of this protein, in the first chapter we have addressed the construction of a MG218-s null strain still expressing the MG218 full-length protein. In order to obtain this mutant, a new strategy to introduce point mutations in the M. genitalium genome has been designed. This strategy allowed the identification of the starting Met of the MG218-s protein and the generation of an MG218-s null mutant that helped to understand the role of this new protein. The second and third chapters are focused on the study of the MG200 protein, which is an important element of the motility machinery. MG200 and MG386 protein are the first elements to be related exclusively to motility in M. genitalium. These proteins share common features, being remarkable the presence of a well conserved Enriched in Aromatic and Glycine Residues domain (EAGR box). This domain is exclusively found in mycoplasmas, apparently always in proteins related with motility and/or with the terminal organelle architecture, as MG312. The analysis of the crystal structure of the MG200 EAGR box supported a role in protein-protein interactions, indicating that it can be a platform for interactions with other macromolecules. However, no apparent structural defects in the TO architecture have been shown by mutant cells bearing deletions in proteins containing EAGR boxes. To further understand the role of this domain, the second chapter analyzes the phenotype of mutants that express the MG200 protein bearing a deletion of the EAGR box domain. The observations made suggest that the EAGR boxes would play a relevant and specific role in motility. Interestingly, MG200 is a multi-domain protein that has homology to the Hsp40 co-chaperones. Transposon disruption of MG_200 locus led to adherent strains with a non-motile phenotype. A recent analysis of these mutants has evidenced the presence of an N-terminus MG200 fragment, which contains a J-domain and a glycine and phenylalanine rich region (G/F) characteristic of DnaJ proteins. In the third chapter, we have studied the contribution of the amino-terminal domains of MG200 in its general function.