Miogènesi i regeneració muscular: paper d'alfa-enolasa/plasminogen i receptor del factor del creixement epitelial

Abstract

L’activitat de la plasmina és clau en el procés de regeneració muscular després d’una lesió. Aquesta proteasa d’ampli espectre de substrat afavoreix l’eliminació de fibrina i col∙lagen extracel∙lulars, i indueix la migració de cèl∙lules del sistema inflamatori a l’àrea danyada, però no es coneix si afecta a les cèl∙lules musculars directament. Estudis previs del grup han identificat l’alfa‐enolasa com a principal receptor del plasminogen en els mioblasts murins i han determinat que la generació i focalització de l’activitat proteolítica de la plasmina a través d’alfa‐enolasa a la superfície dels mioblasts és clau pel procés de miogènesi i regeneració muscular. En aquesta tesi, inicialment s’ha determinat la unió del plasminogen i de la plasmina a la superfície dels mioblasts murins C2C12 i dels cultius primaris de MPCs (Muscle Precursor Cells), i s’ha confirmat la implicació de l’alfa‐enolasa com a principal receptor del plasminogen involucrat. Per fer‐ho s’ha generat un anticòs específic per la isoforma alfa‐enolasa que inhibeix la seva unió al plasminogen. Els estudis realitzats amb aquest nou anticòs, anomenat MAb872, no només han confirmat l’alfa‐enolasa com a principal receptor involucrat en la unió del plasminogen als mioblasts sinó que han demostrat que la inhibició de la unió alfa‐enolasa/plasminogen impedeix la diferenciació i fusió miogènica dels mioblasts murins in vitro i in vivo. Seguidament, s’ha observat que la presència de plasmina unida a la membrana dels mioblasts a través d’alfa‐enolasa indueix l’activació de les vies MAPK/Erk i PI3K/Akt de forma depenent de la seva activitat proteasa. L’alfa‐enolasa no posseeix un domini transmembrana i es desconeix com es localitza a la membrana plasmàtica. La manca de domini intracel∙lular de l’alfa‐enolasa, suggereix la participació de receptors col∙laboradors per poder transduir la senyal a l’espai intracel∙lular. Entre diversos receptors candidats analitzats, observem indicis de la participació de les integrines β1/β3 i l’activació de la via MAPK/Erk a través de Src i FAK. A nivell cel∙lular, la unió de la plasmina als mioblasts provoca canvis en la reorganització del citoesquelet d’actina afavorint la desadherència del substrat i induint la migració cel∙lular. Alhora s’ha demostrat que l’activació de la via PI3K/Akt en presència de plasmina incrementa la supervivència dels mioblasts en situacions d’estrès cel∙lular. Per altra banda, seguint indicis previs del grup que suggerien la participació de EGFR en el procés miogènic, s’ha analitzat l’expressió de EGFR en el múscul esquelètic d’animals wt i animals distròfics mdx, així com durant el procés de regeneració in vivo i el procés de miogènesi in vitro. Els resultats obtinguts mostren una molt baixa expressió i activació de EGFR en el múscul esquelètic adult i un notable increment després d’una lesió muscular o en un múscul adult distròfic. L’anàlisi in vitro ha permès determinar la participació de EGFR en la proliferació i supervivència dels mioblasts i la pèrdua de l’expressió d’aquest receptor a l’inici del procés miogènic. També s’ha observat que la inhibició de l’activitat tirosina quinasa de EGFR estimula la fusió miogènica obtenint més fibres musculars i de major tamany. Aquests resultats suggereixen la inhibició de EGFR com a possible diana terapèutica per estimular els processos miogènics en situacions patològiques, com és el cas de la distròfia muscular de Duchenne. Estudis preliminars de l’administració de AG1478, inhibidor de l’activitat tirosina quinasa de EGFR, en animals mdx indiquen que AG1478 podria millorar el fenotip distròfic d’aquests animals.

Plasmin activity is necessary for muscle regeneration process after an injury. This broad‐spectrum protease is the major enzyme responsible for the dissolution of fibrin and most of the components of ECM and it also promote and lead the migration of inflammatory cells to injured area. However, it is unknown if it plays also a role in muscle cells directly. Pervious results of the group identified alpha‐enolase as the major plasminogen receptor in murine myoblast. Our group also described alphaenolase dependent generation and focalization of plasmin on the myoblasts surface as an essential event in myogenesis and muscle regeneration process. Firstly, in this thesis we have analyzed the capacity of murine myoblast (C2C12 and primary culture of Muscle Precursor Cells or MPCs) to bind plasminogen and plasmin in an alpha‐enolase dependent way, as well the participation of alpha‐enolase in myogenic process. In order to address this question we generated a monoclonal antibody (MAb872) that inhibits plasminogen binding to alpha‐enolase. The results using this antibody corroborate the role of alpha‐enolase as a major plasminogen receptor in myoblast and confirm the impairment of satellite‐cells‐derived myoblast differentiation and fusion in vitro and in vivo, when alpha‐enolase/plasminogen interaction is abrogated. We further observed plasmin binding to alpha‐enolase induces MAPK/Erk and PI3K/Akt pathways in a plasmin activity dependent way. It is unknown how alphaenolase reaches the membrane as it lacks transmembrane domain. Moreover, the absence of intracellular domain suggests that alpha‐enolase collaborates with other receptors to transduce plasmin‐dependent signaling. Among several receptors, we have identified the participation of integrins β1/β3 in the plasmin‐induced MAPK/Erk signaling upstream Src and FAK in myoblasts. The cellular effect of plasmin binding to alpha‐enolase is the reorganization of actin filaments promoting cellular migration. Moreover plasmin activation of PI3K protects murine myoblast from apoptosis in stress conditions suggesting a protective role of this protease. Other previous results in our group suggested the participation of EGFR in myogenic process as well. To address this hypothesis we have analyzed the expression of EGFR in skeletal muscle from wt mice, dystrophic mdx mice and in cardiotoxininjured mice, as well as during myogenesis in vitro. Our results show a reduced basal expression and activation of EGFR in adult non‐injured muscle but high levels of active EGFR in injured and dystrophic muscle. In vitro analysis has revealed that EGFR participates in proliferation and surviving of non‐diferentiated myoblasts and the inhibition and downregulation of EGFR at the beginning of differentiation process. Moreover, EGFR inhibition with AG1478 induces myoblasts differentiation and fusion generating bigger muscle fibers. These results point the inhibition of EGFR as a therapeutic tool in deficient myogenic process as in dystrophic muscles. Preliminary work administrating AG1478 in mdx mice suggest a possible therapeutic effect of this EGFR inhibitor.