Estudi del paper de la sobreexpressió pancreàtica d’IGF-1 en ratolins NOD per contrarestar la diabetis tipus 1

Abstract

La diabetis tipus 1 (T1D) és una malaltia autoimmune causada per la destrucció de les cèl·lules β productores d’insulina. La incidència de la T1D està augmentant arreu del món i cada vegada es diagnostica a edats més joves. Aquesta malaltia esdevé clínicament aparent després d’un període preclínic de longitud variable, durant el qual la destrucció autoimmune redueix la massa de cèl·lula β en l’illot pancreàtic de tal manera que els nivells de glucosa en sang no es poden continuar mantenint en un rang fisiològic. Donat que els pacients de T1D requereixen teràpia amb insulina al llarg de tota la seva vida i presenten un elevat risc de complicacions secundàries, noves teràpies preventives o curatives són necessàries. Entre elles, la teràpia gènica ofereix una nova eina de tractament amb grans possibilitats. Entre els possibles gens candidats al tractament de la diabetis, el factor de creixement a la insulina tipus 1 (IGF-1) destaca per les seves propietats immunomoduladores i el seu control sobre la proliferació i supervivència de la massa de cèl·lula β. El nostre laboratori havia descrit prèviament que la sobreexpressió d’IGF-1 a les cèl·lules β d’animals transgènics contrarresta la citotoxicitat i la insulitis induïda pel tractament amb estreptozotocina (STZ) i potencia la regeneració de l’illot. A més, també ha demostrat que l’expressió pancreàtica d’IGF-1 prevé la destrucció de l’illot i la mort de la cèl·lula β en un ratolí transgènic que sobreexpressa interferó-β (IFN-β) a la cèl·lula β, un model d’infiltració limfocítica del pàncrees endocrí. La primera part d’aquest treball es va centrar en l’estudi del paper d’IGF-1 en la preservació de la massa de cèl·lula β en un model espontani de diabetis autoimmune: el ratolí NOD (Non Obese Diabetic). Amb l’objectiu d’estudiar el mecanisme mitjançant el qual la sobreexpressió d’IGF-1 en les cèl·lules β pot prevenir la destrucció autoimmune del pàncrees endocrí, es van generar ratolins NOD transgènics que sobreexpresaven IGF-1 sota el control del promotor RIP-1 (Rat Insulin Promoter) (NOD-IGF1). Els resultats obtinguts van mostrar que els ratolins transgènics NOD-IGF1 eren resistents al desenvolupament de diabetis. Davant una prevalença del 70% en els ratolins NOD, només un 3% dels ratolins NOD-IGF1 desenvolupaven diabetis a les 30 setmanes d’edat. Aquesta prevenció era mediada per un efecte local d’IGF-1 al pàncrees donat que els nivells circulants del factor no estaven augmentats. La reducció en la incidència de diabetis observada en els animals NOD-IGF1 tenia lloc en paral·lel amb una menor infiltració limfocítica dels illots, menor expressió de citoquines inflamatòries i reducció del nombre de cèl·lules β apoptòtiques, suggerint un bloqueig de l’atac autoimmune contra el pàncrees. Aquest bloqueig podria estar mediat per una reducció de les molècules presentadores d’antígens en els illots i un augment de les cèl·lules T reguladores en el pàncrees. Els ratolins NOD-IGF1 preservaven la massa de cèl·lula β amb el temps, presentaven una insulinèmia normal i mostraven un perfil de tolerància a la glucosa normal després de ser administrats amb una càrrega de glucosa intraperitoneal. Tots aquests resultats indicaven que la producció local d’IGF-1 podia protegir les cèl·lules β de la destrucció induïda pel sistema immune i contrarestava la diabetis en una varietat de models de la malaltia que inclou el ratolí amb desenvolupament espontani de diabetis NOD. Per tant, la transferència del gen IGF-1 a pàncrees podria ser una aproximació segura per al tractament de la diabetis tipus 1. A més, estudis realitzats en el nostre laboratori han demostrat que l’administració intraductal de vectors virals adenoassociats de serotip 8 (AAV8) és capaç de transduir de manera eficient i a llarg termini tant el pàncrees exocrí com les cèl·lules β dels illots. Per tant, l’objectiu de la segona part d’aquest treball va ser combinar l’ús dels vectors AAV8 amb els efectes protectors de l’IGF-1 per a desenvolupar una estratègia de teràpia gènica dirigida al pàncrees per a contrarestar la diabetis autoimmune en el ratolí NOD. Amb aquesta finalitat es va generar un vector AAV8 que expressava IGF-1 sota el control del promotor ubic CAG. Per tal de restringir l’expressió d’IGF-1 al pàncrees es van incorporar al constructe les seqüències diana del microRNA 122a (expressat al fetge) i del miroRNA 1 (expressat al cor)a l’extrem 3’-UTR del constructe. Es va observar que l’administració intraductal d’aquest vector era capaç de prevenir la hiperglucèmia en el ratolí NOD. Així, la majoria dels animals administrats amb el vector AAV8 que codificava per IGF-1 van mostrar valors normals de glucèmia al llarg de les 28 setmanes de seguiment i la incidència de diabetis es va veure significativament reduïda. En conjunt, aquest estudi posa de manifest el paper clau d’IGF-1 en la protecció de la massa de cèl·lula β enfront la destrucció autoimmune, i indica que la transferència gènica d’IGF-1 a pàncrees mitjançant vectors AAV podria representar una nova aproximació de teràpia gènica per la diabetis tipus 1.

Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease caused by the destruction of insulin-producing β cells. The incidence of T1D is increasing worldwide and is being diagnosed at increasingly younger ages. T1D becomes clinically apparent after a preclinical period of varying length, during which autoimmune destruction reduces the mass of β cells in the pancreatic islets such that blood glucose levels can no longer be maintained in a normal physiologic range. T1D patients require life-long insulin treatment and have a high risk of suffering from medical complications. Therefore, preventative or curative therapies are urgently needed. Among them, gene therapy offers a new tool with great potential treatment opportunities for T1D. Among the possible candidate genes for the treatment of diabetes, the insulin growth factor type 1 (IGF-1) is known for its immunomodulatory properties and its control over the proliferation and survival of β cell mass. Our laboratory has previously reported that the overexpression of IGF-1 in β cells of transgenic animals counteracts cytotoxicity and insulitis induced by streptozotocin (STZ) treatment and promotes islet regeneration. We also described that pancreatic expression of IGF-1 prevents islet destruction and β cell death in a transgenic mouse overexpressing IFNβ (Interferon β) in β cells, a model of lymphocytic infiltration in endocrine pancreas. The first part of this thesis is focused on the study of the role of IGF-1 in the preservation of β cell mass in a spontaneous model of autoimmune diabetes: NOD mouse (Non obese Diabetic). With the aim of studying the mechanism by which the overexpression of IGF-1 in β cells can prevent the autoimmune destruction of the endocrine pancreas, we generated NOD transgenic mice that overexpress IGF-1 under the control of RIP-1 promoter (Rat Insulin Promoter-1) (NOD-IGF1). Our results showed that IGF1-NOD mice were resistant to develop diabetes. As the prevalence of diabetes was of 70% in NOD mice, only 3% of the IGF1-NOD mice developed diabetes at 30 weeks of age. This prevention was mediated by the local effect of IGF-1 in pancreas given that the circulating levels of the factor were not increased. The reduction in the incidence of diabetes observed in NOD-IGF1 animals was in parallel with lower islet lymphocytic infiltration, reduced inflammatory cytokine expression and reduced number of apoptotic β cells, suggesting a blockage of the autoimmune attack against the pancreas. This arrest could be mediated by a reduction of antigen-presenting molecules in islets and an increase in regulatory T cells in the pancreas. IGF1-NOD mice preserved β cell mass with time, showed normal insulinemia and a normal glucose tolerance profile after an intraperitoneal glucose load administration. These results indicate that the local production of IGF-1 protected β cells from the destruction induced by the immune system and counteracted diabetes in a variety of models of the disease, including the spontaneously diabetic NOD mouse. Therefore, IGF-1 gene transfer to the pancreas could be a safe approach for the treatment of type 1 diabetes. Furthermore, studies in our laboratory have shown that intraductal administration of adeno-asociated viral vectors with serotype 8 (AAV8) can efficiently transduce long term both the exocrine pancreas and the islet β cells. Thus, the aim of the second part of this study was to combine the use of AAV8 vectors with the protective effects of IGF-1 to develop a gene therapy approach directed to the pancreas in order to counteract autoimmune diabetes in NOD mouse. For this purpose, we generated an AAV8 vector expressing IGF-1 under the control of the ubiquitous CAG promoter. In order to restrict IGF-1 expression in the pancreas, the target sequences of microRNA 122a (expressed in the liver) and micrRNA 1 (expressed in the heart) were incorporated to the 3’-UTR of the construct. It was observed that the intraductal administration of this vector was able to prevent diabetic hyperglycaemia in NOD mouse. Thus, most animals administered with the AAV8 vector encoding the IGF-1 gene showed normal blood glucose values during 28 weeks and a significant reduction in the incidence of diabetes. In conclusion, this study demonstrates the key role of IGF-1 protecting β cell mass against the autoimmune destruction, and indicates that gene transfer of IGF-1 in the pancreas by AAV vectors could represent a new gene therapy approach for the treatment of type 1 diabetes.