Implicación de la vía del TLR4 y de la vía de los IFNs de tipo I y los monocitos en la respuesta clínica a interferón-beta en pacientes con esclerosis múltiple

Abstract

Introducción: El interferón-beta (IFN-β) se utiliza como tratamiento para los pacientes con esclerosis múltiple remitente-recurrente (EMRR). A pesar de su probada eficacia, un considerable porcentaje de pacientes no responden al tratamiento. Estudios previos realizados en nuestro grupo apuntaron a que la vía de los IFNs de tipo I y la vía de los TLRs podrían estar implicadas en la respuesta al tratamiento. Además, se observó que la población celular responsable de la sobre-activación de la vía de los IFNs de tipo I eran los monocitos. Objetivo: Estudiar la implicación de la vía del TLR4 y la vía de los IFNs de tipo I en la respuesta a IFN-β en pacientes con esclerosis múltiple remitente recurrente (EMRR) y caracterizar el perfil transcriptómico de los monocitos periféricos según su respuesta al tratamiento con IFN-β. Materiales y métodos: Se incluyeron pacientes con EMRR tratados con IFN-β y clasificados como respondedores (R) o no respondedores (NR) según su respuesta clínica. Mediante citometría de flujo, se determinó la expresión extracelular de TLR2, TLR4 e IFNAR1 en monocitos CD14+ de estos pacientes. Se analizó también la expresión de genes pertenecientes a la vía del TLR4 y a la vía de los IFNs de tipo I en células mononucleares de sangre periférica. Además, se realizaron microarrays de expresión de monocitos aislados por sorting. Por otro lado, se realizó un estudio genético donde se testaron SNPs localizados en genes de la vía de los IFNs de tipo I y de la vía de los TLRs. Resultados y conclusiones: En cuanto a la vía de los IFNs de tipo I, se observó que el IFN1b endógeno estaba elevado en pacientes NR. Además, IFNAR1, estaba más presente en monocitos de pacientes NR respecto a los R. Por otro lado, el estudio transcriptómico de los monocitos aislados reveló que una de las vías más diferencialmente expresadas entre los dos subgrupos de pacientes era la de los IFNs de tipo I, cuyos genes se encontraban más expresados en NR. Además de la vía de los IFNs de tipo I, otras vías de señalización se encontraban más activadas en los monocitos de pacientes NR. Entre ellas destacan la disfunción mitocondrial, la síntesis proteica y el inmunoproteasoma, todas ellas relacionadas con los IFNs de tipo I. Todos estos hallazgos se encontraron en muestras recogidas antes del inicio al tratamiento. Al estudiar el efecto del IFN-β exógeno, también se observaron diferencias en la expresión de IFN1b entre los R y los NR, tanto ex vivo como in vitro. El IFN-β exógeno indujo la expresión de IFN1b en pacientes R, efecto que no ocurría en pacientes NR. En cuanto a la vía del TLR4, se obtuvo una menor expresión de TLR4 en monocitos del grupo global de pacientes con EMRR respecto a los controles sanos que además correlacionaba con la escala de discapacidad. El tratamiento de un año con IFN-β indujo la expresión de genes de la vía de los TLRs. Es más, aumentó la presencia de TLR4 en la superficie celular de monocitos. Sin embargo, este efecto es independiente de la respuesta clínica al tratamiento por lo que no parece ser determinante en cuanto a la efectividad clínica del mismo. Por otro lado, se encontraron diferencias entre R y NR en la expresión basal de IRAKM, un regulador negativo de la vía Myd88 dependiente. Por último, en el estudio farmacogenético no se validó ningún SNP como marcador genético de respuesta clínica al tratamiento con IFN-β.

Introduction: Recombinant IFN-β is widely used as a treatment for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Although its efficacy has been demonstrated, some patients do not respond to the treatment. Previous studies performed by our group pointed out that type I IFNs pathway and TLR4 pathway might be implicated in the response to the treatment. Additionally, monocytes from patients that do not respond to treatment showed over-activation of STAT1, which is the transcription factor of type I IFNs pathway. Objective: The aim of this thesis is to investigate the implication of TLR4 pathway and type I IFNs pathway in the response of IFN-β in RRMS patients and to characterize the transciptomic profile of peripheral monocytes depending on the clinical response to IFN-β treatment. Materials and methods: RRMS patients included in this study were treated with IFN-β during two years and were classified into responders (R) or non-responders (NR) based on clinical criteria. Extracellular expression of TLR2, TLR4 and IFNAR1 in CD14+ monocytes was determined by flux cytometry. Also, the expression of genes belonging TLR4 and type I IFN pathways was determined in peripheral blood mononuclear cells. The monocyte population was purified from PBMC and differential gene expression between groups was evaluated using oligonucleotide microarrays. Finally, a pharmacogenetic study was performed by genotyping SNPs located in genes belonging to type I IFNs and TLR4 pathways. Results and conclusions: The study of type I IFN pathway revealed that endogenous IFN1b was elevated in NR patients. Also, its receptor, IFNAR, was more expressed in monocytes’ cell surface from NR. Moreover, the transcriptomic study of purified monocytes showed that one of the most differentially expressed pathways between R and NR was the type I IFNs pathway, which genes were more expressed in NR. Apart from the type I IFNs pathway, other signaling pathways related with it, were more activated in the isolated monocytes from NR patients. Among them, mitochondrial dysfunction, protein synthesis and immunoproteosome were found differentially expressed between two groups of MS patients. This outcome was obtained from patients’ samples collected at basal time, before IFN-β treatment was initiated. When studying the effect of exogenous IFN-β, differences were also observed in IFN1b expression between R and NR, at both ex vivo as in vitro level. Monocytes from global RRMS patients expressed lower levels of TLR4 when compared with healthy controls. Besides, this outcome was correlated with disability scale. The first year of treatment with IFN-β induced the expression of genes belonging to TLR4 pathway. Moreover, it increased the presence of TLR4 in the cell surface of monocytes. However, this effect was independent on the clinical response to the treatment. Differences between R and NR were found in the basal expression of IRAKM, a negative regulator of Myd88 dependent pathway. Finally, the pharmacogenetic study did not validate any SNP as genetic marker of clinical response to the IFN-β treatment.