Identificación de interactores del regulador de la homeostasis lipídica AtArv1: caracterización del factor de transcripción anclado a membrana maMYB de Arabidopsis

Abstract

Los estudios realizados sobre la proteína Arv1 en levaduras y animales indican que estaría involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica intracelular, aunque se desconoce su función bioquímica concreta. A. thaliana posee los genes ARV AtARV1 y AtARV2, que codifican las proteínas funcionales AtArv1 y AtArv2, respectivamente, ancladas a la membrana del RE. Partiendo de la hipótesis de que las proteínas AtArv interaccionan con otras proteínas para poder ejercer su función biológica, este trabajo se inició con el cribado de un banco de cDNA de plántulas de Arabidopsis empleando AtArv1 como cebo y la técnica de doble híbrido en levadura (MbYTH), donde se identificó que la proteína maMYB interacciona con AtArv1. La proteína maMYB, codificada por un único gen en Arabidopsis, tiene características de un MTTF de la familia MYB, puesto que contiene un dominio citosólico R2R3-MYB en la región C-terminal y dos DTMs en la región N-terminal. En este sentido, se determinó que maMYB se localiza en las membranas del RE y presenta ambos extremos proyectados hacia el citosol. Además, se demostró que la versión truncada maMYB91-309, que contiene el dominio citosólico R2R3-MYB, se localiza en el núcleo y preferentemente en el nucléolo. El análisis del patrón de expresión de la proteína maMYB reveló que lo hace mayoritariamente en raíz y parte aérea de plántulas de Arabidopsis. Empleando una estrategia de silenciamiento inducible basada en el uso de microRNAs artificiales (amiRNA), se obtuvieron líneas mutantes de maMYB condicionales en donde se observó una reducción pronunciada en los niveles de mRNA y proteína maMYB y una alteración severa del desarrollo de las plántulas de Arabidopsis, que se caracterizó por una reducción del tamaño general de la plántula, una disminución de la longitud de la raíz primaria, una inhibición de la formación de raíces laterales y pelos radiculares, una alteración en la forma, el tamaño y el número de las células de las diferentes capas de la raíz, una desestructuración de las células epiteliales de los cotiledones y una alteración en los niveles de los productos finales de la ruta de esteroles y de sus precursores inmediatos. Mediante el estudio de la expresión génica global con la tecnología RNA‐seq se determinó que el silenciamiento de maMYB provoca la desregulación de grupos de genes involucrados en el desarrollo y el crecimiento de la planta, que son coherentes con el fenotipo observado. Tanto en la raíz como en la parte aérea se identificaron genes desregulados involucrados en la elongación celular y relacionados con la pared celular. En la raíz se identificaron genes desregulados relacionados con la síntesis de chalconas, el transporte de auxinas y la morfogénesis de los pelos radiculares. En la parte aérea se identificaron genes desregulados implicados en la síntesis de fenilpropanoides y auxinas y la respuesta a auxinas. Además, los genes desregulados como consecuencia del silenciamiento de maMYB presentan un alto enriquecimiento de genes regulados epigenéticamente a través de la trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3), lo que sugiere que maMYB podría estar relacionado con este proceso necesario para el correcto desarrollo de la planta. Por otro lado, se observó que la sobreexpresión de maMYB91-309 revierte (en mayor o menor medida) el fenotipo causado por el silenciamiento de maMYB, lo cual avala la funcionalidad in vivo del dominio citosólico y el papel de maMYB como MTTF, cuyo dominio R2R3-MYB citosólico necesitaría liberarse por acción de proteasas intramembrana y trasladarse al núcleo donde ejercería su función. Las alteraciones observadas en el desarrollo de los mutantes de silenciamiento de maMYB sugieren que éste sea un MTTF que se libere en respuesta a estímulos de desarrollo.

In yeast and animals, Arv1 protein is involved in the intracellular lipid homeostasis, although its particular biochemistry function remains unknown. A. thaliana has the ARV genes AtARV1 and AtARV2, which codify the functional proteins AtArv1 and AtArv2, respectively, tethered to the ER membrane. Assuming that AtArv proteins need to interact with other proteins to carry out its biological function, this work was initiated with a screening of a cDNA library from Arabidopsis seedlings using AtArv1 as a bait and the yeast two hybrid version MbYTH, where we identified maMYB as an interactor of AtArv1. maMYB protein, codified by a unique gene in Arabidopsis, has characteristics of MYB family MTTF, since it contains a citosolic R2R3-MYB domain at the C-terminal region and two TMDs at the N-terminal region. In this way, we demonstrated that maMYB is localized in the ER membrane facing both extremes to the citosol, and the truncated form maMYB91-309, which contains the R2R3-MYB domain, is localized in the nucleus and preferentially in the nucleolus. The analysis of the expression pattern of maMYB protein revealed that the highest levels were found in the root and the shoot of Arabidopsis seedlings. Using an inducible silencing strategy based on the artificial microRNAs (amiRNAs) technology, we obtained maMYB inducible silencing mutants that showed a strong alteration in the root and shoot development of Arabidopsis seedlings. Through a global expression study using RNA-seq technology, we determined that maMYB silencing causes the deregulation of gene groups involved in plant development and growth, which is coherent with the observed phenotype. Interestingly, we observed that the maMYB91-309 overexpression revert (at more or less extent) the phenotype caused by maMYB silencing, which support the functionality of the citosolic R2R3-MYB domain in vivo and the role of maMYB as a MTTF, whose R2R3-MYB domain may be released by the action of intramembrane proteases and be transported to the nucleus where it may develop its function. The developmental alterations observed in the maMYB silencing mutants suggest that maMYB might be a MTTF released in respond to developmental cues.