Structural studies on protein-protein interactions: Analysis of the regulation of the DYNLL/LC8 binding to Nek9 and characterization of the enzymes composing the arginine deiminase pathway in mycoplasma penetrans

Abstract

Las interacciones proteína-proteína (PPIs, por sus siglas en inglés) son contactos físicos intencionados que se dan entre dos o más proteínas. Estas interacciones forman la red de interacciones de proteínas y forman el núcleo del sistema interatómica de toda célula viva. Fallos en este sistema producidos por PPIs aberrantes están relacionados con fallos en la transducción de señales. Agregación proteica y una pérdida de regulación celular. De hecho, las PPIs anormales forman parte de las bases de enfermedades como el Alzheimer y el cáncer. La importancia del sistema interatómico hace que sea necesario investigar las PPIs, sus funciones y propiedades estructurales, en diferentes modelos. En este trabajo la cristalografía de rayos X es entre otras técnicas la principal para estudiar las PPIs. La investigación de PPIs se ha llevado a cabo a través de dos modelos experimentales diferentes: En el primero, hemos analizado el rol de la fosforilación en un péptido derivado de la Kinsasa mitótica Nek9 en la unión con LC8, una proteína asociada a Nek9; En el segundo modelo, hemos resuelto las estructuras de los tres enzimas que forman la vía de la arginina deiminasa en Mycoplasma penetrans. La proteína Nek9/Nercc1 de la familia de proteínas Kinasa NIMA juega un papel esencial en el control del huso mitótico. DYNLL/LC8 fue descrita con un complemento del complejo de la dyneina, sin embargo, actualmente se le conocen múltiples proteínas asociadas y de ha propuesto que LC8 tiene un rol general como núcleo de dimerización que dirige varias proteínas. Los últimos trabajos indican que la unión de LC9 con Nek9 está regulada por autofosforilación. En este trabajo proponemos un nuevo mecanismo regulatorio defosforilación que interfiere en la unión de LC8 con sus proteínas asociadas. El metabolismo de la arginina para producir ATP es considerado esencial para microorganismos como Mycoplasma penetrans en condiciones anaeróbicas. Además, esta vía ha sido asociada en los mecanismos de patogenicidad y virulencia en ciertos organismos, por ejemplo, protegiendo del estrés acídico en la infección. En este trabajo presentamos las estructuras de la vía de la arginina deiminasa de M.penetrans: arginina deiminasa (ADI), ornitina carbamoyltransferasa (OTC) and carbamato kinasa (CK). Las estructuras de M.penetrans ADI y CK revelan los cambios estructurales que se dan durante el mecanismo de reacción. En el caso de enzima OCT de M.penetrans comparamos su estructura cuaternaria con otros organismos, incluyendo termófilos, revelando la formación de esta estructura cuaternaria común organizada por unas interfaces con una baja homología de secuencia. Los resultados presentados en esta tesis enfatizan la importante contribución de la cristalografía de rayos X para estudiar las propiedades de las PPIs. La regulación de de las PPIs, sus diferencias estructurales y funcionales dependientes de su asociación, modificaciones posttraducionales y la adaptación a ambiental a través de la evolución son algunas de las propiedades y factores de dependencia de las PPIs estudiadas en este trabajo de tesis.

Protein-Protein Interactions (PPIs) are intentional physical contacts established between two or more proteins. These interactions form the large protein interaction network and are the core of the entire interatomic system of any living cell. Flaws in the interaction network by aberrant PPIs involve signal transduction fails, protein aggregation and a completely loss of cell's regulation. Indeed, missense PPIs are the basis of multiple diseases, such as Alzheimer's disease and cancer. The significance of the interatomic system makes worth to studying PPIs, their functions and structural properties, in different models. In the present work X-ray crystallography is the main technique used, in addition to other methods to study Protein-Protein interactions. The study of protein-protein interactions is performed through two different experimental models: In the first model, we analyzed the role of phosphorylation in the interaction of a peptide derived from the mitotic kinase Nek9 with its binding partner LC8; In the second model, we decipher the structures of the three enzymes composing the arginine deiminase pathway in Mycoplasma penetrans. The NIMA family protein kinase Nek9/Nercc1 plays a main role in the control of the mitotic spindle. DYNLL/LC8 was originally described as a component of the dynein complex, but the recent discovery of multiple interaction partners for LC8 has proposed that it has a general role as a dimerization hub that organizes different protein partners. Recent experiments suggested that LC8 binding to Nek9 was regulated by Nek9 autophosphorylation. The present work sheds light into a novel phosphorylation regulatory mechanism that interferes with LC8 protein-protein complex formation. The metabolism of arginine towards ATP synthesis has been considered a major source of energy for microorganisms such as Mycoplasma penetrans in anaerobic conditions. Additionally, this pathway has also been implicated in pathogenic and virulence mechanism of certain microorganisms, i.e. protection from acidic stress during infection. In this work we present the crystal structures of the three enzymes composing the gene cluster of the arginine deiminase pathway from M.penetrans: arginine deiminase (ADI), ornithine carbamoyltransferase (OTC) and carbamate kinase (CK). M.penetrans ADI and CK structures disclose the structural conformation shifts upon the reaction mechanism of these proteins. In the case of M.penetrans OCT its dodecameric quaternary structure is compared with other organisms (including some thermophiles), revealing the formation common quaternary structure arranged interfaces with a low sequence homology. The results collected in this thesis emphasize the important contribution of X-ray crystallography for studding PPIs properties. PPIs regulation, structural and functional differences depending on their association, posttranslational modifications and the environment adaptation thought evolution are some of the PPI properties and dependence factors studied in this thesis work.