Structural and functional studies on the regulation of the USP28 de-ubiquitinase and the SENP5 de-SUMOylase

Abstract

USP28 és un enzim de-ubiquitinasa (DUBs), homologa a USP25, que pertany a la família USPs. USP28 s’ha involucrat en apoptosis induïda per IR i en l’estabilitat de vari regulador de DDR (Reparació de Dany al DNA). D’altra banda, SENP5 és una proteasa especifica per Sentrin/SUMO de la família de SENP, que s’ha descrit que està involucrada en mitosi i citocinesi. En aquesta tesi, el principal objectiu ha estat la resolució de les seves estructures cristal·lines i la caracterització de la regulació de la seva activitat proteolítica. Respecte a la part de USP28, hem aconseguit produir diferent constructes del seu Domini Catalític (CD) i de la regió N-terminal (NT), i hem caracteritzat les seves activitats sobre diferent substrats poli-Ubiquitina. També hem identificat el lloc de SUMOilització primari de USP28 per Espectrometria de Masses (K99). També hem aconseguit obtenir cristalls del NT de USP28 i del CD de USP25. Desafortunadament, la difracció d’aquests cristalls és dèbil i la seva estructura no s’ha pogut resoldre. També hem identificat l’especificitat de cadena di-Ubiquitin en USP28 (K11, K48 i K63 cadenes). Els nostres assajos in vitro indiquen que l’activitat proteolítica de USP28 es pot regular per modificació covalent per SUMO a la regió N-terminal. De totes formes, la presencia de la regió N-terminal no és estrictament necessària per l’activitat USP28. Si considerem que tenim un domini SIM, un domini UBA i dos dominis UIMs a la regió N-terminal, fóra interessant estudiar aquest aspecte amb més detall en el futur. Respecte a la part de SENP, hem posat molts esforços en la producció d’una construcció soluble del Domini Catalític (CD) de SENP3 i SENP5. Finalment, hem aconseguit produir en grans quantitats un constructe soluble de SENP5-CD en E.coli. Hem caracteritzat in vitro les reaccions de processament de SUMO i de deconjugació de SUMO. També ham format complexes entre un mutant inactiu de SENP5-CD-C712S amb el precursor de SUMO2 (Sp5-S2p) i amb el substrat RanGAP1-SUMO2. Només hem aconseguit obtenir cristalls de Sp5-S2p, malauradament la difracció era tan dèbil que no hem pogut resoldre l’estructura a alta resolució.

USP28 is a member of a family of deubiquitinating enzymes (DUBs), homologous to USP25, belonging to the USP family. USP28 has been involved in IR-induced apoptosis and in the stability of numerous DDR regulators. On the other hand, SENP5 is a member of the Sentrin/SUMO-specific proteases (SENP) in humans, which is reported to be involved in mitosis and/or cytokinesis. In this thesis, the main goal has been to elucidate their crystal structures and to characterize the regulation of their proteolytic activities. With respect to the USP28, we have produced different constructs of their Catalytic Domain (CD) and N-terminal región (NT), and have characterized their activities against different poly-Ubiquitin substrates. We have also identified the USP28 SUMOylation primary site by Mass Spectrometry (K99). We have been able to obtain nice crystals of the NT of USP28 and of the CD of USP25. Unfortunately, the diffractions of these crystals were weak and the structure could not be solved. We have also identified the di-Ubiquitin chain specificity of USP28 (K11, K48 and K63 linkages). Our in vitro analysis indicates that the USP28 proteolytic activity can be regulated by covalent SUMO modification at the N-terminal region; however, the presence of this N-terminal region is not strictly necessary for the USP28 activity. Considering there are one SIM, one UBA and two UIMs in the N-terminal region, this issue would be interesting to be explored deeply in the future. Regarding to the SENP part, we have put many efforts on the protein expression of different constructs of the Catalytic Domains (CD) of SENP3 and SENP5. Finally we have been able to produce in high yields a soluble construct of SENP5-CD in E.coli. We have characterized the SUMO processing and SUMO deconjugation reactions of SENP5-CD. We also have formed complexes between the inactive mutant of the SENP5-CD-C712S with SUMO2 precursor (Sp5-S2p) and with RanGAP1-SUMO2 substrates. We could only get crystals of Sp5-S2p, however the diffraction was so weak that we could not solve the structure at high resolution.