Epigenetic mechanisms in colorectal cancer

Abstract

Mitjançant tècniques d’anàlisi de tot el genoma hem sigut capaços d'identificar regions diferencialment metilades entre teixit de colon normal i tumoral provinents del mateix pacient. Un dels gens més importants és AKR1B1, l'illa CpG associada al promotor d’aquest gen esdevé hipermetilada en un 90% dels càncers colorectals estudiats (més de 200), aquesta troballa ha estat confirmada en dos sets de mostres independents. Sorprenentment, la hipermetilació no està acompanyada per una clara baixada de l’expressió d’AKR1B1, de fet vam observar que aquesta hipermetilació estava associada amb el silenciament dels gens AKR1B10 i AKR1B15 (tots ells membres de la mateixa família d’aldo-keto reductases), localitzats a 60 Kbs de l'illa CpG. Utilitzant tècniques per esbrinar l'estructura de la cromatina dins del nucli vam observar que l'illa CpG es troba en contacte amb el promotor de AKR1B10, el que indica una possible funció d’enhancer per a l'illa CpG. Aquesta funció enhancer va ser corroborada mitjançant assajos de luciferasa i demostrada in situ mitjançant l’alteració de la regió enhancer, utilitzant la tècnica d’edició genòmica CRISPR. A més a més, l’acció enhancer va ser recuperada en models cel·lulars gràcies a l’acció de diverses drogues epigenètiques, que produïen l’activació de l’enhancer (observable per la reaparició de la marca H3K27ac) i la reactivació de l’expressió d’AKR1B10 i AKR1B15. En aquest treball també s’avalua l’impacte de la hipermetilació en la via de l’àcid retinoic, a la qual pertanyen els enzims de la família AKR1B. Observem que la via està fortament hipermetilada i, en conseqüència, silenciada. El fet més remarcable a nivell clínic és que aquestes alteracions poden servir com a marcador de pronòstic de la malaltia i com a marcador de diagnòstic no invasiu.

By applying a genome-wide approach to detect differential methylation between colorectal tumors and their paired normal tissue we identified a number of genes that suffer hypermethylation in colorectal cancer. One of the most interesting genes was AKR1B1, which promoter CpG island became hypermethylated in about 90% of all the colorectal cancers samples analyzed. Unexpectedly, this hypermethylation was not accompanied by a clear downregulation of the AKR1B1 transcript. After extending the analysis to the neighboring genes, we realized that this hypermethylation was actually associated with silencing of AKR1B10 and AKR1B15 genes (all of them members of the same aldo-keto reductase gene family), located 60 Kb upstream of the methylated CpG island. Using techniques to elucidate the chromatin structure within the nucleus, we realized that the CpG island was in close contact with the AKR1B10 promoter, what indicates a putative enhancer role for the CpG island. This enhancer function was checked using luciferase assays and was demonstrated in situ through the alteration of the enhancer region, using the genome editing technique CRISPR. Moreover, the enhancer activity was recovered using cellular models through the treatments with different epigenetic drugs, which produced the activation of the enhancer (with the characteristic H3K27ac mark) and the reexpression of AKR1B10 and AKR1B15 genes. In this work we also evaluated the impact of the hypermethylation in the retinoic acid pathway, where AKR1B enzymes belong to. We observed a strong hypermethylation of the retinoic acid pathway and, as a consequence, silencing. The most remarkable finding is that those alterations can be used to predict the outcome of the disease and also as a non-invasive diagnostic marker.