Expressió diferencial i funció de les isoformes de l’immunoreceptor de la família SLAM CD84 en malalties autoimmunes

Abstract

Les malalties autoimmunes es caracteritzen per una pèrdua de la tolerància als antígens propis que dóna lloc a l'aparició de limfòcits autoreactius. La susceptibilitat genètica és un factor determinant en el desenvolupament de l'autoimmunitat i és el resultat de l’acció combinada de diversos gens. S'han identificat diferents locus de susceptibilitat i polimorfismes dels gens que contribueixen al desenvolupament de l'autoimmunitat sistèmica. Entre d'altres, s’ha trobat un locus principal de susceptibilitat al lupus eritematós sistèmic (LES) en ratolins (Sle1b) i humans (1q23) localitzat en el cromosoma 1 (Wang et al) que conté els gens de la família SLAM (Signaling Lymphocyte Activation Molecule), un grup de receptors de membrana amb importants funcions immunoreguladores. Els membres de la família SLAM han estat identificats, en els últims anys, com un grup de receptors que modulen l'activació i la diferenciació d'una àmplia gamma de tipus cel·lulars involucrats en la resposta immune innata i adaptativa. La família SLAM està constituïda per nou molècules de membrana pertanyents a la superfamília de les immunoglobulines (IgSF): SLAMF1, SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229 o LY9)), SLAMF4 (CD244 o 2B4), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (CD352 o NTB-a), SLAMF7 (CD319 o Cracco), SLAMF8 (CD353 o BLAME) i SLAMF9, que s'expressen diferencialment en les cèl·lules del sistema hematopoètic. La regió extracel·lular d'aquests receptors conté típicament un domini immunoglobulina (Ig) variable (IgV) en l'extrem N-terminal i un domini Ig constant (IgC2) a l'extrem C-terminal, excepte SLAMF3 (CD229), que està format per dos sèries de IgV / IgC2. A través d'aquests dominis estableixen interaccions específiques amb els seus lligands, la majoria dels casos de tipus homofílic, excepte la proteïna CD48 que és el receptor de CD224. Els lligands de SLAMF8 i 9 no s'han descrit fins ara. Sis dels receptors SLAM contenen un o més motius ITSM (Immunoreceptors Tyrosine-based switch motif) en la seva cua citoplasmàtica, que serveixen com a llocs d'unió per a molècules adaptadores i enzims amb dominis SH2 (Src homology 2 domains). Les molècules adaptadores SAP (SLAM-associated protein), EAT-2 (EWS / FLI activated transcript-2) i ERT (EAT-2 related Transducer) tenen una gran afinitat per aquest motiu. Estudis amb ratolins mostren l'expressió diferencial de dues isoformes de Ly108 (SLAMF6), que difereixen en la seva regió citoplasmàtica, entre ratolins normals i ratolins susceptibles al lupus. L'expressió de la isoforma Ly108-1, amb dos dominis ITSM, es troba incrementada respecte a l'altra isoforma Ly108-2, amb tres motius ITSM, a les cèl·lules B i T de ratolins susceptibles al lupus en comparació amb ratolins normals. Darrers estudis d'aquesta proteïna demostren l'existència d'una nova isoforma (Ly108-H1), absent en ratolins susceptibles al lupus i que protegeix d'aquesta malaltia als ratolins transgènics. Recentment, s’ha descrit una expressió alterada de dos receptors SLAM, CD244 i CD319, i una expressió diferencial d'isoformes d'aquestes molècules en pacients amb LES. Per tant, un concepte emergent derivat d'aquest i d'altres estudis, és que l'expressió diferencial d'isoformes dels receptors SLAM pot contribuir a la susceptibilitat a trencar l’autotolerància. Un dels membres d'aquesta família és la proteïna CD84, la qual ha estat caracteritzada i estudiada àmpliament en el nostre grup durant els últims anys. Es tracta d'una proteïna d'uns 50-80 kDa depenent del seu grau de glicosilació, amb un ectodomini format per un domini IgV en el seu extrem N-terminal al que li falta el pont disulfur; i un domini IgC2 en el seu extrem C-terminal amb dos ponts disulfur. La seva cua citoplasmàtica conté dos dominis ITSM mitjançant els quals s'uneix al domini SH2 de diferents molècules adaptadores, entre elles SAP. La interacció homofílica té lloc a través del domini IgV. RESULTATS 1. CD84 té almenys quatre ARN missatgers diferents La base de dades ECgene descriu set isoformes de la proteïna CD84. Només en quatre d'aquestes isoformes s'han localitzat seqüències d’ARN missatger i d'ESTs (Expressed Sequence Tag), que juntament amb una estructura proteica compatible, farien possible que aquestes isoformes expressessin a nivell de proteïna. Els estudis in silico realitzats van demostrar que el transcrit H1C22218.5, amb dues seqüències d'ARNm i 91 ESTs correspondria al gen íntegre o full length (CD84_FL); amb una regió codificant de 1017 pb formada per vuit exons. El transcrit H1C22218.2, amb una seqüència d'ARNm i 66 ESTs té una regió codificant de 642 pb a la qual li falten els exons 2 i 5 (CD84_Delta2, 5). En canvi el transcrit H1C22218.3, amb 5 seqüències d'ARNm i 93 ESTs està format per 984 pb i li falta l'exó 5 (CD84_Delta5). Finalment, el transcrit H1C22218.4, amb una seqüència d'ARNm i 88 ESTs està format per 816 pb i li falten els exons 5 i 6 (CD84_Delta5, 6). Estudis previs del grup van demostrar que CD84 s'expressa a nivell de proteïna en diverses línies cel·lulars del sistema immune. Per aquesta raó, i amb la intenció d'esbrinar si les isoformes descrites en les bases de dades eren presents en aquestes línies cel·lulars, es van dur a terme diferents PCR amb oligonucleòtids específics per CD84 dissenyats a les unions dels exons per aconseguir una major especificitat. La primera PCR correspon a una amplificació de la cua citoplasmàtica i dóna lloc a tres bandes de 341 pb, 308 pb i 210 pb. La seqüenciació de les bandes obtingudes demostrar que la banda de 341 pb corresponia a la proteïna íntegra (CD84_FL), mentre que la banda de 308 pb corresponia a una cua citoplasmàtica amb un exó menys, que coincidia amb les seqüències dels transcrits CD84_ Delta2, 5 i CD84_Delta5. Finalment, la banda de 272 pb amplificar una seqüència coincident amb CD84_Delta5, 6. Una segona PCR amb els oligonucleòtids dissenyats a la unió dels exons 1-3, unió present únicament en la possible isoforma CD84_ Delta2,5, va permetre diferenciar entre aquest transcrit i el CD84_Delta5. La seqüenciació de la banda obtinguda va confirmar que es corresponia amb el transcrit CD84_ Delta2,5. L'amplificació de la cua citoplasmàtica en les diferents línies cel·lulars va demostrar que almenys tres de les quatre isoformes esmentades s'expressen en diferents línies cel·lulars com cèl·lules B (Ramos, Namalwa, Raji, Daudi i Cess), cèl·lules T (Jurkat, Hsb2 i Molt4), cèl·lules mieloides (Hl60, U937, K562 i THP-1) i NK (Yt i Nkl). Les isoformes esmentades també es troben expressades en cèl·lules de sang perifèrica de voluntaris sans, en melsa i en amígdala amb una expressió de CD84_Delta5, 6 molt marcada a melsa. La PCR específica per al transcrit CD84_Delta2, 5 demostrar que aquest es troba lleugerament expressat en algunes cèl·lules T i B, però no en NK, PBMC, melsa i amígdala.

2. La isoforma CD84_Delta2, 5 no s'expressa en la membrana Diversos assajos per FACS en cèl·lules · cèl·lules COS-7 transfectades transitòriament amb la construcció pCDNA3.1 CD84_Delta2, 5 i amb l’anticòs a-CD84 2151, el qual reconeix el segon domini immunoglobulina de la proteïna, no van permetre identificar la isoforma. El marcatge intracel·lular per comprovar la presència de la isoforma al citoplasma, també va ser negatiu. Es va decidir doncs utilitzar una construcció de la isoforma que contingués el tag fluorescent GFP, per estudiar la localització de la proteïna. Es van transfectar transitòriament cèl·lules COS-7 i es va observar el resultat en el microscopi de fluorescència, indicant que la proteïna no es troba localitzada a la membrana. A causa de que el nostre interès per aquesta isoforma es centra en el possible paper funcional que podria tenir en faltar-li el domini responsable de l'adhesió, es va decidir seguir amb els assajos funcionals sense estudiar aquesta isoforma.

3. L'anticòs 688.1 contra la cua citoplasmàtica de CD84_Delta5, 6 reconeix específicament aquesta isoforma Aprofitant que la isoforma CD84_Delta5, 6 té en la seqüència de nucleòtids de la seva cua citoplasmàtica un canvi en la pauta de lectura que genera una seqüència d'aminoàcids única, es va generar un anticòs que reconegués específicament aquesta cua. La validació de l'anticòs demostrar que aquest no reconeix la resta d'isoformes de CD84 en transfectants transitoris de cèl·lules COS-7 per FACS, però sí que reconeix la isoforma d'interès. També es va demostrar que l'anticòs 688.1 immunoprecipita específicament la isoforma CD84_Delta5, 6 a transfectants transitoris de cèl·lules COS-7. La immunofluorescència en cèl·lules adherents transfectades transitòriament també mostra l’especificitat d'aquest anticòs enfront de la proteïna íntegra.

4. La isoforma CD84_Delta5, 6 s'expressa diferencialment en les línies cel·lulars testades Un cop identificades les isoformes i analitzada la seva expressió a nivell gènic, l'anticòs generat permetre analitzar l'expressió de l’isoforma CD84_Delta5, 6 a nivell de proteïna. Els estudis per FACS demostren que aquesta està present en totes les línies cel·lulars testades, i els nivells d'expressió es correlacionen amb els resultats obtinguts a nivell gènic, indicant que l'anticòs és sensible a l'expressió diferencial en cadascuna de les línies. D'aquesta manera, mentre que la proteïna CD84 total s'expressa de manera important en les línies de cèl·lules B, els nivells de isoforma CD84_Delta5,6 són baixos en aquest tipus cel·lular. En canvi, en línies de cèl·lules T, on generalment CD84 es troba expressada en un nivell més baix, la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió relativa més elevada. Els nivells més alts d'expressió de la isoforma es troben en les línies de llinatge mieloide, on l'expressió de CD84 total també és alta. En el cas de les línies de cèl·lules NK gairebé la totalitat del CD84 trobat correspon a la isoforma.

5. La isoforma CD84 Delta5, 6 es detecta en les diferents subpoblacions de PBMC estudiades L'anàlisi per citometria de flux en les diferents subpoblacions de PBMC va permetre conèixer l'expressió diferencial de CD84_Delta5, 6 en individus sans. La subpoblació B1 de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5 +), la qual està involucrada en la immunitat humoral, té una expressió de la isoforma més elevada que la resta de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5-). En les cèl·lules T CD4 +, les cèl·lules memòria expressen més la proteïna total que les cèl·lules verges (CD3 + CD4 + CD45ROlow), mentre que la isoforma s'expressa de manera similar en ambdues poblacions. Pel que fa a les cèl·lules · cèl·lules T reguladores (CD4 + CD25 + FoxP3 +), tant el nivell de CD84 total com el de la isoforma és significatiu. En les cèl·lules T CD8 +, l'expressió de CD84 és considerablement més important en cèl·lules efectores memòria (CD8 + CD45RA-CCR7-) que en cèl·lules centrals memòria (CD8 + CD45RA-CCR7 +), com també ho és l'expressió de la isoforma. En canvi, les cèl·lules naïve (CD8 + CD45RA + CCR7 +), tot i tenir una expressió de CD84 total similar a les cèl·lules efectores (CD8 + CD45RA + CCR7-), tenen una expressió de CD84_Delta5, 6 més elevada que aquesta. En cèl·lules NK (CD3-CD16 + CD56 +), l'expressió de la isoforma és elevada en relació a l'expressió de CD84 total. Els monòcits tenen una expressió significativa tant de CD84 com de CD84_Delta5, 6.

6. La isoforma CD84 Delta5, 6 s'internalitza deficientment respecte la proteïna CD84 Estudis d'activació de cèl·lules Jurkat transfectades amb els ADNc de les diferents isoformes van demostrar que la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió més alta després de l'activació que la resta d’isoformes. Això va fer pensar que probablement el fet de no tenir la cua citoplasmàtica amb les quatre tirosines, donaria lloc a un reciclatge deficient de la proteïna i en conseqüència, d'una acumulació en la membrana. Per demostrar si això era cert, es van fer diversos estudis d'internalització amb diferents procediments de citometria, com l’ús de l'aparell Amnis, que combina la citometria de flux amb la microscòpia de fluorescència i permet veure la localització de la proteïna marcada en una cèl·lula. El resultat obtingut va demostrar que les cèl·lules Jurkat transfectades amb la isoforma CD84_Delta5, 6 tenen una internalització més baixa que les transfectades amb CD84_FL, en condicions normals, el que incrementa amb l'activació. 7. Estudi de l'expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a malalties autoimmunes Deu pacients de LES i dotze d'AR van participar en l'estudi de l’expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a les diferents subpoblacions de PBMC analitzades en l'apartat 5. Els resultats obtinguts van ser comparats amb els valors d'expressió dels mateixos paràmetres de dotze voluntaris sans. D'altra banda, es comparar l'expressió de CD84 amb un altre membre de la família SLAM, NTBA, el qual ha estat assenyalat com una proteïna implicada en algunes malalties autoimmunes. En termes generals, es va veure un augment de l'expressió de CD84_Delta5, 6 a totes les subpoblacions estudiades de malalts de LES, resultat que coincideix en un estat d'activació en els estudis in vitro. En AR en canvi, els resultats assenyalen una tendència contrària en algunes subpoblacions.

CONCLUSIONS

Les isoformes de CD84 d'estudi han estat identificades per PCR en les línies cel·lulars d'interès. S'ha vist que aquestes isoformes es troben expressades de forma diferencial tant en les línies cel·lulars com en cultius primaris. Inicialment la isoforma CD84_Delta2, 5 ens va semblar interessant perquè en faltar el primer domini immunoglobulina, a través del qual té lloc la interacció homofílica, donaria lloc a importants deficiències en la interacció amb altres cèl·lules. Però els resultats observats mostren que la isoforma no transloca a la membrana, el que pot ser degut al fet que part del pèptid líder forma part del segon exó, absent en aquesta isoforma. La manca d'aquest fragment de pèptid líder podria fer que la proteïna no tingués la capacitat de translocar a la membrana. La isoforma CD84_Delta5, 6 té una deficient internalització causa probablement a la manca dels motius tirosina de la seva cua citoplasmàtica.

La generació dels anticossos específics per a la isoforma CD84_Delta5, 6 ens va permetre estudiar l'expressió d'aquesta isoforma tant en línies cel·lulars com en les diferents subpoblacions de sang perifèrica. S'ha vist una expressió diferencial en les diferents subpoblacions estudiades, la qual cosa pot estar indicant un paper funcional important d'aquesta isoforma.

Una possible explicació que es desprèn dels resultats amb pacients de LES i AR podria ser que la presència de més CD84_Delta5, 6 a la membrana fa que, encara que la proteïna no sigui funcionalment activa a nivell de senyalització intracel·lular, produeixi més adhesió i per tant afavoreixi la senyalització d'altres molècules coestimuladores, donant lloc a una hiperactivació del sistema immune.

La conclusió final que es pot extreure d'aquest treball és que hi ha indicis que demostren que CD84 i els seus isoformes podrien tenir un paper important en la ruptura de la tolerància i el desenvolupament de la autoimmunitat. Les dues malalties estudiades, LES i AR, han donat resultats oposats. D'una banda, sembla ser que en el LES ha lloc una activació cel·lular.

L'expressió més elevada de la isoforma en cèl·lules naïve podria indicar que CD84 és un factor de susceptibilitat al desenvolupament d'aquesta malaltia. D'altra banda, en AR no s'observa diferència d'expressió en els malalts sense tractament, mentre que el grup tractat presenta un increment de la proporció entre la proteïna total i la isoforma, suggerint que CD84 podria ser un biomarcador en el tractament de l’artritis.

The membrane protein CD84 belongs to SLAM family, in the immunoglobulins superfamily. It was established as a molecule CD (cluster of differentiation) in 1995 in the 6th International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA). In recent years, the SLAM family members have been identified as a group receptors that modulate the activation and differentiation of various cell types involved in the innate and adaptive immune response. In addition, many studies indicate that the genetic region where SLAM family genes are located is a susceptibility locus for Systemic lupus erythematosus (SLE). In the last years, it has been demonstrated some evidences that shows a clear implication of polymorphisms and alternative splicing isoforms generated by different members SLAM family in the development of certain autoimmune diseases, especially in SLE. Following this way, an emerging concept is that the differential expression of isoforms of SLAM receptors may contribute to susceptibility to break self-tolerance. Moreover, studies in our group showed that CD84 is a costimulatory protein widely expressed in the hematopoietic system, both human and mouse. It is in this context that we characterized different isoforms of CD84 and its study possible involvement in the development of autoimmunity.