Papel de EF-Tu en la interacción de Pseudomonas aeruginosa con los queratinocitos humanos

Abstract

Introducción: Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que causa una gran variedad de infecciones, entre las que destacan las infecciones respiratorias agudas y crónicas y las infecciones de heridas por quemaduras. En un trabajo previo, usamos anticuerpos específicos para detectar la presencia del epítopo de fosforilcolina en la superficie bacteriana asociado al factor de elongación Tu (EF-Tu). Identificamos que el gen eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) es el responsable de la incorporación de fosforilcolina a EF-Tu. Además demostramos que este epítopo es crucial para la colonización inicial del tracto respiratorio por P. aeruginosa y el desarrollo de neumonía. En esta tesis hemos investigado la contribución de la fosforilcolina en la interacción de P. aeruginosa con los queratinocitos epidérmicos humanos y en las infecciones de heridas por quemadura causadas por este patógeno. Contenido de la investigación: La proteína EF-Tu recombinante purificada de un aislado clínico y de un mutante isogénico desprovisto del gen eftM funcional fue analizada por espectrometría de masas. El análisis comparativo demostró que el producto de eftM es una metiltransferasa (EftM) que incorpora tres grupos metilo al residuo 5 de lisina de EF-Tu dando lugar a un epítopo estructuralmente igual a la fosforilcolina. Mediante la combinación de técnicas de fraccionamiento celular, microscopía electrónica e inmunología, demostramos que EftM trimetila EF-Tu en el citoplasma, el cual es posteriormente transportado a la membrana externa, dejando el residuo 5 trimetilado expuesto hacia el exterior. Los ensayos de invasión y transmigración con cultivos de queratinocitos humanos polarizados infectados con la cepa parental o el mutante en eftM demostraron que la trimetilación de EF-Tu media la migración de P. aeruginosa a través de la barrera epitelial. Esto es debido a que la cepa parental es capaz de alterar, de forma más eficiente que el mutante, la permeabilidad de la barrera epitelial mediante la reducción de la expresión de ZO-1, una proteína clave para la integridad del epitelio. Los ensayos con un antagonista del receptor del factor activador de plaquetas (PAFR) demostraron que este receptor media la interacción de P. aeruginosa con los queratinocitos a través de EF-Tu trimetilado. Sin embargo, la reducción de ZO-1 no es debida directamente a la interacción EF-Tu-PAFR, sino que está inducida por la activación, por parte de P. aeruginosa, del factor de transcripción celular NF-κB. Finalmente, los experimentos en un modelo murino de infección por quemadura demostraron que la mutación de eftM reduce notablemente la virulencia y la capacidad de diseminación de P. aeruginosa. Conclusiones: Se ha identificado el gen eftM, que codifica una nueva metiltransferasa que incorpora tres grupos metilo al residuo 5 de lisina de EF-Tu. EftM está muy conservado y ampliamente distribuido entre especies y es necesario y suficiente para metilar EF-Tu en P. aeruginosa o en otros sistemas heterólogos. EF-Tu está en la membrana externa exponiendo la región N-terminal trimetilada hacia el exterior. Dicha trimetilación facilita la invasión y transmigración bacteriana a través de queratinocitos humanos mediante la interacción con PAFR. P. aeruginosa reduce los niveles de proteína ZO-1 incrementando la permeabilidad paracelular de la barrera epitelial, proceso mediado por la activación de NF-κB. La carencia de EftM reduce la virulencia de P. aeruginosa en un modelo murino de infección de quemadura. La nueva metiltransferasa podría ser una nueva diana para el diseño de fármacos contra P. aeruginosa.

Introducció: Pseudomonas aeruginosa és un patogen oportunista que causa una gran varietat d’infeccions, entre les quals destaquen les infeccions respiratòries agudes i cròniques i les infeccions de ferides per cremada. A un treball previ, vàrem utilitzar anticossos específics per detectar la presència de l’epítop de fosforilcolina a la superfície del bacteri associat al factor d’elongació Tu (EF-Tu). Vàrem identificar que el gen eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) és el responsable de la incorporació de fosforilcolina a EF-Tu. A més a més demostrarem que aquest epítop és clau per la colonització inicial del tracte respiratori per P. aeruginosa i el desenvolupament de pneumònia. En aquesta tesi hem investigat la contribució de la fosforilcolina a la interacció de P. aeruginosa amb els queratinocits epidèrmics humans i a les infeccions de ferides per cremades causades per aquest patogen. Contingut de la recerca: La proteïna EF-Tu recombinant purificada d’un aïllament clínic i d’un mutant isogènic desproveït del gen eftM funcional va ser analitzat per espectrometria de masses. L’anàlisi comparativa va demostrar que el producte de eftM és una metiltranferasa (EftM) que incorpora tres grups metil al residu 5 de lisina de EF-Tu donant lloc a un epítop estructuralment igual a la fosforilcolina. Mitjançant la combinació de tècniques de fraccionament cel·lular, microscopia electrònica i immunologia, hem demostrat que EftM trimetila EF-Tu al citoplasma, el qual és posteriorment transportat a la membrana externa, deixant el residu 5 trimetilat expossat cap a l’exterior. Els assajos d’invasió i transmigració amb cultius de queratinocits humans polaritzats infectats amb la soca parental o el mutant d’eftM demostraren que la trimetilació d’ EF-Tu facilita la migración de P. aeruginosa a través de la barrera epitelial. Això és degut al fet que la soca parental és capaç d’alterar, de forma més eficient que el mutant, la permeabilitat de la barrera epitelial mitjançant la reducció de l’expressió de ZO-1, una proteïna clau per a la integritat de l’epiteli. Els assajos amb un antagonista del receptor del factor activador de plaquetes (PAFR) demostraren que aquest receptor actua com a intermediari en la interacció de P. aeruginosa amb els queratinòcits a través d’EF-Tu trimetilat. No obstant això, la reducció de ZO-1 no és deguda directament a la interacció EF-Tu-PAFR, sino que està induïda per l’activació, per part de P. aeruginosa, del factor de transcripció cel·lular NF-κB. Finalment, els experiments a un model murí d’infecció per cremada demostraren que la mutació d’eftM redueix la virulència i la capacitat de disseminació de P. aeruginosa. Conclusions: S’ha identificat el gen eftM, que codifica una nova metiltransferasa que incorpora tres grups metil al residu 5 de lisina d’EF-Tu. EftM està molt conservat i àmpliament distribuït entre espècies i és necessari i suficient per metilar EF-Tu a P. aeruginosa o a altres sistemes heteròlegs. EF-Tu està a la membrana externa exposant la regió N-terminal trimetilada cap a l’exterior. Aquesta trimetilació facilita la invasió i transmigració bacteriana a través de queratinocits humans mitjançant la interacció amb PAFR. P. aeruginosa redueix els nivells de proteïna ZO-1, incrementant la permeabilitat paracel·lular de la barrera epitelial, procés mitjançat per l’activació de NF-κB. La mancança d´EftM redueix la virulència de P. aeruginosa a un model murí d’infecció de cremada. La nova metiltransferasa podria ser una nova diana pel disseny de fàrmacs contra P. aeruginosa.

Introduction: Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of a wide range of infections including acute and chronic respiratory infections and wound burn infections. In a previous study, we used specific antibodies to detect the presence of the phosphorylcholine epitope on the bacterial surface linked to the elongation factor Tu (EF-Tu). We identified the gene eftM (Elongation Factor Tu Modifying enzime) as the responsible of the modification of EF-Tu with phosphorylcholine. In addition, we demonstrated that this epitope is crucial for initial colonization of the respiratory tract by P. aeruginosa and for development of pneumonia. In this Thesis we have investigated the contribution of the phosphorylcholine in the interaction of P. aeruginosa with the human epidermic keratinocytes and in the burn wound infections caused by this pathogen. Research: A tandem mass spectrometry analysis was choosen to compare recombinant EF-Tu purified from a clinical isolate and from an isogenic eftM deficient mutant. Comparative analysis shown that the product of eftM, is a methyltransferase (EftM) that transfers three methyl groups to the lysine residue 5 of EF-Tu resulting in a chemical structure similar to phosphorylcholine. Through a combination of approaches, including sub-cellular fractionation, electronic microscopy and immunological techniques, we demonstrated that EftM trymethylates EF-Tu in the cytoplasm, which is subsequently transported to the outer membrane, leaving the trimethylated residue 5 exposed outwards. Invasion and transmigration experiments with cultured human polarized keratinocytes infected with the wild-type strain or the eftM mutant demonstrated that the trimethylation of EF-Tu mediates the migration of P. aeruginosa through the epithelial barrier. Accordingly, the wild-type strain increased the paracellular permeability and reduced the expression of ZO-1, a key protein for the integrity of the epithelial barrier, more efficiently than the mutant. An antagonist of the platelet activating factor receptor (PAFR) reduced the invasion and transmigration of the wild type strain but had no effect on the mutant suggesting that PAFR on the keratinocytes mediates the interaction with the modified EF-Tu. However, reduction of ZO-1 is not directly due to the interaction EF-Tu-PAFR, but is due to the activation of the transcription factor NF-κB induced by P. aeruginosa. Finally, we demonstrated the mutation of eftM impaired the virulence and the dissemination capacity of P. aeruginosa in murine model of wound burn infection. Conclusions: We have identified the gen eftM, encoding a novel methyltransferase, which links three methyl groups to the lysine residue 5 of EF-Tu. EftM is conserved and widely distributed among different species and is sufficient and necessary to methylate EF-Tu in P. aeruginosa and other heterologous systems. EF-Tu is on the outer membrane exposing the N-terminal trimethylated region outward. Trimethylation of EF-Tu promotes invasion and transmigration of the microorganisms via PAFR. Activation of NF-κB by P. aeruginosa induces the reduction of ZO-1 and increase the paracellular permeability of the epithelial barrier. Mutation of eftM reduces the virulence of P. aeruginosa in a murine model of wound burn infection. This opens up new avenues for the development of new drugs targeting this new methyltransferase.