Estudi de la contribució de CenH3ClD en la funció centromèrica. Identificació i anàlisi funcional de noves proteïnes centromèriques a Drosophila

Abstract

El centròmer és l’estructura cromosòmica implicada en la correcta segregació de la informació genètica durant els processos de meiosi i mitosi. La funció centromèrica està determinada epigenèticament per la presència de la variant centromèrica de la histona H3 (CenH3). Aquesta variant substitueix a la histona H3 canònica en els nucleosomes de tots els centròmers funcionals, sent fonamental la seva localització pel correcte assemblatge del cinetocor. En cèl·lules de vertebrats, els nucleosomes de CenH3 actuen com la plataforma necessària pel reclutament de les proteïnes centromèriques que formen el CCAN (Constitutive centromere-associated network). En cada mitosi, les proteïnes del CCAN recluten els components de la xarxa KMN per formar un cinetocor funcional. Mentre que per algunes espècies s’han identificat algunes de les proteïnes homòlogues a les del CCAN, en el cas de D. melanogaster es desconeixen totes, a excepció de CENP-C.

En aquest treball per tal d’identificar i caracteritzar noves proteïnes centromèriques a Drosophila s’ha realitzat la purificació i identificació de les proteïnes associades als nucleosomes de CenH3 de Drosophila, CenH3CID. Entre altres, hem identificat la proteïna Barrier-to-autointegration factor (BAF). Aquesta proteïna està conservada i té un paper clau en el reassemblatge de la membrana nuclear un cop finalitzada la mitosi. Hem observat que dBAF es localitza en la heterocromatina de les cèl·lules SL2 en interfase però, un cop iniciada la mitosi aquesta es localitza exclusivament en els centròmers dels cromosomes metafàsics. A més, hem detectat que dBAF intervé en la deposició i/o estabilització de CENP-C en els centròmers, ja que la sobreexpressió del dominant negatiu dBAF-YFP o la depleció de dBAF afecten els nivells centromèrics de CENP-C. CENP-C interacciona amb dBAF, i aquesta interacció depèn de l’estat de fosforilació de dBAF i de RNA. En les nostres purificacions també s’ha identificat la proteïna codificada pel gen CG8289. Els nostres assajos d’immunolocalització a cèl·lules SL2, neuroblastos i a cromosomes politènics confirmen que la proteïna codificada pel gen CG8289 és un nou factor de la heterocromatina pericentromèrica de D. melanogaster.

Per altra banda, també hem analitzat la contribució del domini N-terminal de CenH3CID (N-CenH3CID) en l’assemblatge del cinetocor. Concretament, hem observat que el reclutament ectòpic de N-CenH3CID davant d’un gen reporter indueix el silenciament d’aquest gen degut al reclutament de BubR1, una proteïna del cinetocor que està relacionada amb el punt de control de la mitosi. Aquest efecte depèn d’un domini del N-CenH3CID conservat entre les diferents espècies del grup de Drosophila i ric en arginines. Els nostres resultats mostren que aquestes arginines són necessàries per produir el silenciament, ja que la seva deleció o mutació per alanines elimina pràcticament el silenciament del gen reporter. A més, el reclutament dels dominis N-terminals de CenH3s de S. cerevisiae i de humans també indueixen el silenciament del gen reporter, indicant que malgrat el baix grau de conservació d’aquest domini entre espècies, la contribució de CenH3 en el reclutament de proteïnes del cinetocor està evolutivament conservada.

Per últim, s’ha confirmat la contribució de la proteïna F-box Ppa en l’estabilitat de CenH3CID. Ppa reconeix específicament el domini CATD de CenH3CID, induint la poliubiquitinació i posterior degradació d’aquesta variant via proteosoma.

Centromere identity and function is regulated epigenetically by the deposition of a centromere-specific histone H3 variant (CenH3). CenH3-nucleosomes act as platform for recruitment of other centromere associated proteins, such as CCAN (Constitutive centromere-associated network) components. These proteins participate in kinetochore assembly during mitosis. In Drosophila, little is known about proteins associated to CenH3-nucleosomes. Here, we have performed purification of CenH3 CID-TAP nucleosomes and subsequent analysis of their associated proteins by mass spectrometry. Among others, we identified Barrier-to-autointegration factor (BAF), a protein related with the reassembly of nuclear envelop at the end of mitosis. Our results show that dBAF binds across heterochromatin in interphase but, at mitosis, is restricted to centromeres. In addition, dBAF mediates CENP-C assembly, since overexpression of a dominant-negative dBAF-YFP form and depletion of dBAF affect centromeric CENP-C. dBAF interacts with CENP-C, as they co-immunoprecipate. In our purification, we also detected the protein encoded by the CG8289 gene. Immunolocalization experiments in SL2 cells, neuroblasts and polytene chromosomes confirm that protein encoded by the CG8289 gene is a new factor of pericentric heterochromatin.

In addition, we have analyzed the contribution of the N-terminal domain of CenH3CID (N-CenH3 CID) in kinetochore assembly. Specifically, we have found that ectopic recruitment of N-CenH3CID in front of a reporter gene induces silencing of this due to recruitment of BubR1, a kinetochore protein that is a core component of the spindle attachment checkpoint (SAC). This interaction depends on a short arginine (R)-rich motif conserved within the Drosophila genus. Our results show these arginines are necessary for gene silencing, since silencing induced by N-CenH3CID is strongly impaired when R-residues are replaced by alanine or deleted. In addition, the recruitment of N-CenH3 of S. cerevisiae and humans also induce silencing of the reporter gene, indicating that despite the low degree of conservation of this domain between species, the contribution of the CenH3 recruitment of kinetochore proteins is evolutionarily conserved. Finally, we have shown that the F-box protein Ppa regulates stability of CenH3CID. PPA specifically recognizes the CATD of CenH3CID, inducing polyubiquitination and subsequent proteasome-mediated degradation of this variant.