Pathogenesis of 2009 pandemic influenza a virus (H1N1) infection in the ferret model

Abstract

La infección causada por el virus influenza A (VIA) causa una enfermedad aguda y recurrente con graves consecuencias sobre la salud pública mundial. El VIA es altamente contagioso y único entre las infecciones humanas presenta dos patrones epidemiológicos. Uno como epidemias estacionales anuales y otro como pandemias cada largo periodo de tiempo. En el 2009 se produjo la primera pandemia del siclo XXI, la cual presentó alta morbilidad causando más de 250.000 muertes alrededor del mundo. La mortalidad observada durante la pandemia fue similar a la observada en previas epidemias estacionales. Sin embargo, adultos jóvenes y niños resultaron desproporcionalmente afectados, resultando en un 60% de los casos descritos. Desde el inicio de la pandemia, el virus H1N1pandémico se ha establecido alrededor del mundo desplazando al anterior virus H1N1 estacional. Actualmente, la infección causada por el virus H1N1 pandémico resulta primordialmente en enfermedad leve, no obstante puede resultar en enfermedad grave en algunos casos. Los casos severos descritos se han relacionado con altos niveles de replicación viral acompañados de respuestas inflamatorias exacerbadas. La patogénesis causada por la infección del virus pandémico H1N1 es el resultado de varios procesos los cuales involucran tanto las capacidades infectivas virales como la respuesta inmunitaria del huésped. Por lo tanto, el entendimiento de ambas características y sus interacciones es importante para el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas contra la infección. Varias investigaciones se han llevado a cabo para entender la patofisiología de la infección de los VIA. Entre los modelos animales utilizados, el hurón es uno de los modelos más atractivos ya que hurones y humanos comparten una fisiología pulmonar y una enfermedad clínica similar. Sin embargo, el hurón presenta varios inconvenientes, entre los cuales se encuentra la limitada caracterización de su sistema inmune. En el estudio I de esta tesis, se han caracterizado diferentes aspectos del sistema inmune del hurón para posteriormente utilizar el modelo de hurón en la infección experimental de diferentes aislados humanos del virus pandémico H1N1 para finalmente estudiar las interacciones ocurridas entre el virus y la respuesta inmune del huésped. En el estudio II, se han estudiado las diferentes virulencias de dos aislados virales con características víricas semejantes, pero que resultaron en patología de diferente gravedad, en los respectivos pacientes humanos (síntomas leves versus fallecimiento). En el estudio III, se han estudiado la diferentes virulencias de dos aislados virales con diferentes características víricas (un virus natural y un virus resistente a Oselamivir portador de la mutación “H275Y”), los cuales fueron aislados de pacientes humanos que desarrollaron infecciones fatales. La infección experimental en hurones con diferentes virus pandémicos H1N1 humanos se asoció a daño pulmonar de diferentes grados. En general, las lesiones pulmonares más severas correlacionaron con replicación viral en aéreas alveolares, elevada expresión de genes inductores de citoquinas a nivel pulmonar y presencia de infiltrados inflamatorios pulmonares. Nuestros resultados han revelado que la presencia de replicación viral en áreas alveolares no está únicamente relacionada con las capacidades infectivas virales sino también con el tipo de respuesta inmune inducida por el huésped. Animales infectados con cepas virales de similares características, desarrollaron diferentes grados patológicos dependiendo del tipo/magnitud de la respuesta inmune del huésped e independientemente de la cepa vírica inoculada. Por el contrario, en el caso de animales infectados experimentalmente con cepas virales con diferentes mutaciones afectando la velocidad de replicación viral, la patogenia observada en los animales se relacionó con la cinética viral del inoculo. Los hurones infectados con el virus resistente al antiviral Oseltamivir presentaron una patología más leve en comparación con los hurones infectados con un aislado vírico natural. En ambos estudios, las lesiones pulmonares severas correlacionaron con la presencia de replicación viral en pneumocitos y con un aumento en la expresión de los genes de la inmunidad innata TLR3, IL-6, CXCL10, CCL5, CCL3, IL-8 además de los marcadores apoptóticos (BAX y CASP8). Estos perfiles de expresión genética, a su vez se correlacionaron con el fenotipo de células inflamatorias observadas en los pulmones. El fenotipo celular se caracterizó por altos números de macrófagos y neutrófilos en apoptosis acompañados de elevados números de células T citotóxicas y células NK. Por el contario, las lesiones pulmonares leves se correlacionaron con la presencia de replicación viral restringida a áreas bronquiolares además de un aumento en la expresión génica de los genes de la inmunidad innata IFN tipo I y RIG-I, sugiriendo que la inducción de IFN tras la infección por VIA es beneficiaria para el huésped. La entrada de leucocitos a los pulmones está marcada por la señalización de moléculas de la inmunidad innata, como las citoquinas y las quemoquinas, las cuales inducen la migración de diferentes tipos celulares a los pulmones. En el estudio IV, hemos utilizando la técnica de microdisección de captura láser para estudiar la expresión génica y por lo tanto la señalización de la inmunidad innata en diferentes compartimentos anatómicos pulmonares (bronquiolar, alveolar y vascular), en respuesta a la infección por el virus pandémico H1N1 en hurones. Los resultados obtenidos han identificado a las áreas bronquiolares y alveolares como las primeras inductoras de la respuesta inmune innata tras la infección y por tanto responsables del primer influjo de células inflamatorias, a través de la expresión génica de IFNα, IFNγ, IL-6 y TNF. Sin embargo, la expresión de TLR3 y CCL2 fue principalmente observada en áreas vasculares durante la infección. Asimismo, las áreas vasculares también presentaron una elevada expresión de los genes IFNγ e IL-6, apuntando a su importante contribución en el influjo de células inflamatorias al pulmón y en la inducción de la respuesta innata en los primeros estadios de la infección. A pesar de que no se observó la presencia de antígeno vírico y por tanto de replicación activa del virus en áreas vasculares. Sí, se detectaron elevados niveles de ARN viral por RT-PCR a tiempo real en áreas vasculares. Estos resultados indican que las áreas vasculares pulmonares podrían contribuir a la inducción de la respuesta inmune innata a través del reconocimiento de RNA viral o a través de la comunicación con células infectadas en otras áreas pulmonares. La presente tesis subraya la importancia de la localización de replicación viral junto con la correcta orquestación de la respuesta inflamatoria inmune temprana como factores determinantes en el desarrollo de patología severa, tras la infección con el VIA. Creemos que esta tesis proporciona datos nuevos para clarificar el rol del la respuesta inmune en la patogenia divergente observada tras la infección del virus H1N1 pandémico del 2009. El entendimiento de las interacciones entre las características víricas genéticas y la respuesta inmunológica del huésped son importantes para el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas contra la infección por el virus influenza.

Influenza A virus (IAV) infection is an acute and recurring respiratory disease which has an elevated effect on public health worldwide. IAV infection is highly contagious and unique among human viruses, having two epidemiological modes, as seasonal epidemics, or over longer time periods, as pandemics. The first pandemic of the 21st century occurred in 2009 by an H1N1 type virus, causing high rates of morbidity and more than 250.000 deaths around the world. Overall, the case fatality rate was similar to that of seasonal influenza. However, previously healthy young adults and children were disproportionally affected, accounting for more than 60% of the reported cases. The pandemic H1N1 virus has now been established itself worldwide, replacing the previous seasonal H1N1 virus. Currently, the infection causes predominantly mild disease, but it can develop onto severe illness in some cases. Severe pandemic H1N1 outcomes have been related to high viral replication capacities and exacerbated host inflammatory immune responses. The pathogenesis of pandemic H1N1 infection results from various processes involving the host immune system and their response to virus-induced changes. Understanding both virus and host response characteristics in severe and mild infection cases is important for the future development of therapeutic strategies. Several investigations have been carried out in order to understand the physiopathology of pandemic H1N1 infection. Among influenza animal models, the ferret is an attractive model due to the fact that they share similar lung physiology with humans and demonstrate a similar disease entity, without prior viral adaptation. However, the immune system of ferrets has not been very well characterised. In study I of this dissertation, we characterised different immune system cells in ferret tissues in order to then characterise viral-host interactions, occurring in the lungs of H1N1v infected ferrets. In study II, we used the ferret model to study the differences in virulence of two human viral isolates, presenting similar genetic characteristics, yet resulting in different disease outcomes in human patients (death vs. mild symptoms). In study III, we studied two human viral isolates with different genetic characteristics (one wild type virus and one virus with the H275Y mutation, conferring resistance to Oseltamivir antivirals) in patients who developed the same disease outcome (death). The experimental infection of ferrets with human H1N1 viral isolates was associated with different degrees of lung damage. More severe lung lesions correlated with viral replication in alveolar areas, higher proinflammatory cytokine release in the lungs, and higher lung inflammatory infiltrates, as observed in human patients. Our results revealed that the presence of viral replication in alveolar areas was not only related to viral capacities, but also to the type of host immune response triggered by the infection. In the case of viral strains with similar viral capacities, the development of severe or mild disease depended on the type of immune response triggered by the host. Infected animals showed different pathological outcomes, depending on the type/magnitude of the host immune response, and independently of the viral strain inoculums. On the contrary, in the presence of viral mutations affecting viral growth, pathogenicity was related to viral kinetics. Ferrets infected with the Oseltamivir resistant virus (presenting slower viral kinetics) presented milder pathological lesions, when compared with ferrets infected with the wild type isolate. In both studies, more severe lung lesions correlated with viral replication in alveolar areas and higher expression of the proinflammatory cytokines IL-6, CXCL10, CCL5, CCL3, IL-8, TLR3, and apoptotic markers (BAX and CASP8). These cytokine profiles correlated with the inflammatory phenotype observed in the lungs, characterised by high numbers of macrophages and neutrophils in apoptosis, accompanied by large numbers of cytotoxic T, and NK cells. In contrast, milder lung lesions correlated with viral replication, mainly occurring in bronchiolar areas, and with a higher induction of type I IFN and RIG-I genes, suggesting that IFN induction is beneficial for the host, after IAV infection. From the above mentioned observations, we hypothesized that the different expression of proinflammatory genes, and therefore, the income of leukocytes to the lungs, plays a role in the development of severe pathology after influenza infection. The income of leukocytes into the lungs is mediated through the signalling effects of innate immune molecules, like cytokines and chemokines, induced by different cell types in the lungs. In the study IV, we studied the induction of different innate immune molecules in different lung anatomic compartments (bronchiolar, alveolar and vascular), in response to pandemic H1N1 infection in the ferret model, by means of laser capture microdissection. Our results showed that bronchiolar areas initiate the innate immune response and the first influx of inflammatory cells after viral infection, through the expression of IFNα, IL-6, TNFα and IFNγ. However, TLR3 and CCL2 expression was mainly observed on vascular areas throughout infection, and vascular areas also presented an up-regulated expression of IL-6 and IFNγ, indicating its contribution to the innate immune response during early stages of infection. Interestingly, viral RNA was also detected by real time RT-PCR in vascular areas, but no viral replication by immunohistochemistry was observed. From these results, we hypothesized that vascular areas induce an innate immune response at early stages post infection, through the recognition of viral RNA or a crosstalk with infected cells. The present dissertation highlights the notion that viral replication location and the correct orchestration of the early inflammatory immune response are key factors in the development of severe influenza. We believe that this thesis provides new data which aids in clarifying the role of the host immune response in the divergent pathogenesis observed in pandemic H1N1 infection. Understanding the interactions between both viral genetic characteristics within the host immunogenetic context is of great importance to the development of future therapeutic strategies, against influenza infection.