From bee venom to blood-brain barrier shuttles. Development of minimized apamin derivatives for brain delivery of antibodies and other cargoes

Abstract

Brain delivery is a major unmet challenge because most drugs cannot cross the blood-brain barrier (BBB). Despite the restrictive nature of this barrier, brain vasculature reaches essentially every neural cell to supply it with nutrients. BBB-shuttles are molecules that take advantage of endogenous transport mechanisms to deliver cargoes into the brain parenchyma. However, the efficiency and selectivity of current shuttles needs to be improved. It has recently been shown that one way to enhance their transport capacity is to make them protease-resistant. The main goals of this thesis were to find new protease-resistant BBB-shuttle peptides and also to increase the transport monoclonal antibodies across the barrier.

A source of peptides with high resistance to proteases is venoms. Moreover, some components, such as the potassium channel blocker apamin, have an effect on the CNS without disrupting the BBB, which makes them good BBB-shuttle candidates. Firstly, we proved that apamin and the most similar analogue described not to be toxic had a similar permeability in a bovine cell-based BBB model, which indicated that the residues implied in toxicity were not required for the transport across the BBB. Then we generated a simplified analogue, MiniAp-1, which crossed the cell monolayer mainly through an active mechanism with higher permeability than apamin. This result encouraged us to prepare additional analogues and one of them, MiniAp-4, had a permeability 3-fold that of apamin. This increase in transport could be partly explained by its high resistance to serum proteases and its different conformational preferences with respect to the other analogues. We then demonstrated that MiniAp-4 significantly improved the transport of GFP, quantum dots and gold nanoparticles in a human cellbased model of the BBB. Finally, we showed that this peptide was capable of enhancing 7.6-fold the delivery of cyanine-5.5 in mice brain. Furthermore, we detected the targeted probe in the brain parenchyma.

In parallel, we aimed to increase the transport of monoclonal antibodies against glioblastoma across the BBB. We set up five reactions to conjugate peptide shuttles to different parts of two antibodies. Modification of the transaminated N-termini through oxime ligation provided a peptide/antibody ratio (PAR) lower than 1. Conjugation of the fucose present in the glycan chains yielded a PAR of 2 with one antibody but was not applied to the other because of its complex glycosylation pattern. Conversely, we achieved a PAR of 4 on partially reduced interchain cystines of both antibodies. Hence, we used this method to generate a small library of BBB-shuttle-antibody conjugates. The thioether bond linking the shuttles to the antibodies proved stable at least for 24 h in human serum. We also linked peptides containing cysteines to the lysines using cuppercatalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). No conjugation significantly reduced antibody affinity except for N-terminal ligation. When the library of conjugates was assayed in the human cell-based BBB model we observed a significant increase of the transport with most peptides. MiniAp-1 and RVG29 were the shuttles providing the highest enhancement. Regarding the modification site, conjugation to lysines using CuAAC was the most suitable, probably because shuttles are more accessible to their receptors.

In conclusion, in this thesis we have shown that cyclic mini-apamins, with reduced toxicity and immunogenicity, are highly resistant to serum proteases and are capable of crossing a tight brain endothelial cell monolayer. MiniAp-4 efficiently delivers diverse cargoes across the BBB in a human cell-based model and in mice. We have also proved that some BBB-shuttles, particularly MiniAp-1 and RVG29, can enhance the transport of monoclonal antibodies in a cell-based model and that peptides linked to the lysines using CuAAC provide the highest increase.

La major part de fàrmacs dissenyats per tractar malalties del sistema nerviós central no són efectius perquè no poden creuar la barrera hematoencefàlica (BHE). Una de les estratègies més prometedores per superar aquest obstacle és l’ús de llançadores peptídiques. Tanmateix, l’eficiència i selectivitat d’aquests encara s’ha de millorar. Els objectius principals de la tesi eren, per una banda, trobar noves llançadores resistents a proteases i, per l’altra, augmentar el transport d’anticossos monoclonals a través de la BHE.

Tenint en compte que l’apamina és un pèptid del verí de l’abella que creua la BHE, vam iniciar l’estudi demostrant que els residus implicats en la toxicitat no eren necessaris pel transport. Aleshores vam generar anàlegs simplificats i MiniAp-4 va mostrar el millor compromís entre estabilitat en sèrum, permeabilitat i immunogenicitat. Aquest pèptid va incrementar el transport de la GFP, quantum dots i nanopartícules d’or en un model cel·lular humà de BHE. A més, va augmentar en 7,6 vegades la concentració de cianina-5.5 en el cervell de ratolins.

Pel que fa el transport d’anticossos, vam posar a punt diversos mètodes per conjugar els pèptids llançadora a diferents parts de la immunoglobulina, incloent els extrems Nterminals, les cadenes glicosídiques, les lisines i les cisteïnes. Cap conjugació va disminuir l’afinitat dels anticossos pels seus epítops exceptuant la del N-terminal. Vam escollir la modificació de les cisteïnes utilitzant química tiol-maleimida i també la de les lisines mitjançant cicloaddició alquí-azida catalitzada per coure (CuAAC) per generar conjugats emprant diverses llançadores. Alguns d’aquests van mostrar un transport significativament més elevat que l’anticòs sol en el model cel·lular humà de BHE, en especial una mini-apamina i el RVG29 enllaçats mitjançant CuAAC. La major eficiència de les llançadores amb aquesta unió és atribuïble a la major accessibilitat per interaccionar amb els seus receptors.

Per concloure, en aquesta tesi hem generat anàlegs d’apamina resistents a protaeses, més reduïts, menys tòxics i menys immunogènics. A més, MiniAp-4 és capaç de transportar diversos compostos a través de la BHE in vitro i in vivo. També hem demostrat que el transport d’anticossos es pot augmentar mitjançant diferents llançadores peptídiques, incloent les mini-apamines.

La mayor parte de fármacos diseñados para tratar enfermedades del sistema nervioso central no son efectivos porque no pueden cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Una de las estrategias más prometedoras para superar este obstáculo es el uso de lanzadoras peptídicas. Sin embargo, la eficiencia y selectividad de dichas lanzadoras aún debe mejorar. Los objetivos principales de la tesis eran encontrar nuevas lanzadoras resistentes a proteases y aumentar el transporte de anticuerpos monoclonales a través de la BHE. Teniendo en cuenta que la apamina es un péptido del veneno de la abeja que cruza la BHE, iniciamos el estudio demostrando que los residuos implicados en la toxicidad no eran necesarios para el transporte. Luego generamos análogos simplificados y MiniAp-4 mostró un mejor compromiso entre estabilidad en suero, permeabilidad y inmunogenicidad. Este péptido incrementó el transporte de GFP, quantum dots y nanopartículas de oro en un modelo celular humano de BHE. A demás, aumentó en 7,6 veces la concentración de cianina-5.5 en el cerebro de ratones. Por lo que se refiere al transporte de anticuerpos, pusimos a punto varios métodos de conjugación de los péptidos lanzadora a distintas partes de la inmunoglobulina, incluyendo extremos N-terminales, cadenas de oligosacáridos, lisinas y cisteínas. Ninguna conjugación disminuyó la afinidad de los anticuerpos por sus epítopos exceptuando la del N-terminal. Escogimos la modificación de cisteínas mediante química tiol-maleimida y también la de lisinas utilizando cicloadición alquino-azida catalizada por cobre (CuAAC) para generar conjugados usando varias lanzadoras. Algunos de ellos mostraron un transporte significativamente más elevado que el anticuerpo sin modificar en el modelo humano de BHE, en especial una mini-apamina y RVG29 enlazados mediante CuAAC. La mayor eficiencia de las lanzadoras unidas de este modo es atribuible a la mayor accesibilidad para interaccionar con sus receptores. En conclusión, en esta tesis hemos generado análogos de apamina resistentes a proteasas, más reducidos así como menos tóxicos e inmunogénicos. Además, MiniAp-4 es capaz de transportar distintos compuestos a través de la BHE in vitro e in vivo. También hemos demostrado que el transporte de anticuerpos se puede aumentar mediante el uso de lanzadores peptídicas varias, incluyendo las mini-apaminas.