Estudi del compartiment proliferant i quimioresistent en la Leucèmia Limfàtica Crònica. Modelització i identificació d’una nova diana terapèutica

Abstract

La leucèmia limfàtica crònica (LLC), el més tipus de leucèmia més freqüent en el món occidental, es caracteritza per l’acumulació i proliferació de limfòcits B madurs CD5+ en sang perifèrica (SP), ganglis limfàtics (GL) i moll de l’os (MO). Històricament, s’havia descrit que l’acumulació de cèl·lules d’LLC era deguda més a un defecte en l’apoptosi que a un augment en la seva proliferació. No obstant, estudis recents demostren l’existència d’una fracció de cèl·lules d’LLC proliferants que es troba principalment en els GL i el MO, en aquestes localitzacions les cèl·lules d’LLC formen unes estructures histològiques anomenades “centres proliferatius” o “pseudofol·licles”. En aquest microambient, les cèl·lules d’LLC reben senyals provinents d’altres tipus cel·lulars com els limfòcits T i les cèl·lules mesenquimals. Aquests senyals es propaguen a través de receptors com el CD40, els TLR (de l’anglès, toll-like receptors), el CXCR4 i el receptor dels limfòcits B (BCR, de l’anglès B cell receptor) que al seu torn activen vies de senyalització que finalment promouen la proliferació, la quimiotaxi i protegeixen les cèl·lules d’LLC de l’apoptosi espontània i induïda per fàrmacs. Les cèl·lules d’LLC que persisteixen després del tractament en aquests nínxols protectors estarien contribuint a la persistència i progressió de la malaltia residual observada en tots els pacients d’LLC després del tractament. En el primer treball, amb l’objectiu de caracteritzar aquest compartiment de cèl·lules d’LLC proliferants i quimioresistents vam dissenyar un model de cocultiu in vitro de cèl·lules primàries d’LLC amb cèl·lules estromals del MO, lligand del CD40 i CpG ODN per tal de reproduir parcialment el microambient dels centres proliferatius. Aquest sistema de cocultiu va induir proliferació i quimioresistència en les cèl·lules d’LLC. De forma important, les cèl·lules d’LLC cocultivades compartien moltes característiques fenotípiques amb les cèl·lules d’LLC proliferants de SP, com per exemple la sobreexpressió de ZAP-70,CD38 i de les integrines CD49d i CD62L. Això indicaria una major agressivitat i capacitat per a interaccionar amb les cèl·lules circundants, respectivament. A més a més, els nivells de CXCR4 es trobaren disminuits probablement degut a una interiorització després de l’estimulació pel CXCL12 a través de les cèl·lules mesenquimals del MO. Aquests resultats suggereixen que aquest sistema de cocultiu podria utilitzar-se per a testar nous fàrmacs i potencials combinacions dirigides a erradicar les cèl·lules d’LLC proliferants i quimioresistents. En el segon treball, vam observar inicialment com la survivina, una proteïna antiapoptòtica, es trobava expressada específicament en aquelles cèl·lules d’LLC cultivades en el nostre sistema de cocultiu. Per tal de tractar específicament les cèl·lules d’LLC proliferants i quimioresistents, vam estudiar els efectes del tractament amb YM155, un inhibidor de survivina. I el que vam observar va ser que l’YM155 suprimïa l’expressió induïda pel co-cultiu de la survivina, i com això va ser suficient per inhibir la proliferació i induir eficaçment l’apoptosi del compartiment proliferant de cèl·lules d’LLC. A més a més, la sensibilitat al tractament amb YM155 va resultar independent a l’existència de marcadors de mal pronòstic, com la delecció del cromosoma 17p. Per tant, aquests resultats demostren per primer cop l’eficàcia in vitro de l’YM155 en les cèl·lules d’LLC proliferants el que dóna suport al desenvolupament clínic d’aquest fàrmac en pacients diagnosticats d’LLC.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common type of leukemia in western countries, is characterized by the accumulation and proliferation of monoclonal CD5+ mature B cells in peripheral blood, lymph nodes (LN) and bone marrow (BM). Historycally, CLL cells had been described to accumulate as a result of a defective apoptosis, rather than of an increased proliferation. However, recent studies have shown that a distinc fraction of CLL cells are proliferating. CLL cells mainly receive proliferative signals in tissue compartments, such as LN and BM, where CLL cells form aggregates of activated, proliferating cells called “proliferation centers” or “pseudofollicles”. Within this tissue microenvironment, CLL cells receive advantageous signals from accessory cells such as T cells and mesenchymal cells. These signals are propagated through diverse receptors, such as CD40, Toll-like receptor (TLR), CXCR4 and the B cell receptor (BCR), which activate downstream signaling pathways that ultimately promote proliferation, modulate cell adhesion and chemotaxis and protect CLL cells from spontaneous and drug-induced apoptosis. Residual leukemic cells residing in these protective niches after treatment are therefore potentially contributing to minimal residual disease persistence and to the disease relapse virtually observed in all patients after chemotherapy even after achievement of complete remission. In the first study, with the aim of characterizing this proliferative and chemoresistant CLL cells compartment, we designed a co-culture system of primary CLL cells cultured with BM stromal cells, CD40 ligand and CpG ODN to partially mimic the microenvironment in the proliferative centers. This co-culture system induced proliferation and chemoresistance in primary CLL cells. Importantly, co-cultured primary CLL cells shared many phemotypical features with circulating proliferative CLL cells, such as upregulation of ZAP-70 and CD38 and higher CD49d and CD62L expression. This indicates aggressiveness and capability to interact with surrounding cells, respectively. In addition, levels of CXCR4 were decreased due to CXCR4 internalization after CXCL12 stimulation by BM stromal cells. We suggest that this co-culture system can be used to test drugs and their combinations that target the proliferative and drug resistant CLL cells. In the second study, we iniatially observed that survivin, an anti-apoptotic protein, was specifically expressed in those CLL cells cultured in our coculture model. With the aim of specifically targeting actively proliferating and chemoresistant CLL cells, we investigated the effects of treatment with YM155, a small-molecule survivin inhibitor, in this co-culture system. YM155 treatment suppressed the co-culture-induced survivin expression and that was sufficient to inhibit proliferation and effectively induce apoptosis particularly in the proliferative subset of CLL cells. Interestingly, sensitivity to YM155 was independent from common prognostic markers, including 17p13.1 deletion. Altogether, these findings provide a rationale for clinical development of YM155 in CLL.