Aportacions a l’estudi de la relació inflamació-tumorigènesi en el còlon.

Abstract

La colitis ulcerosa (UC) s’associa a un alt risc de desenvolupar càncer colorectal (CRC). La resposta inflamatòria i, en particular, alguns receptors de la immunitat innata com els TLR, condicionen la resposta immune, intervenen en el manteniment de la funció barrera intestinal i en la modulació de mecanismes reparadors, processos relacionats amb la resolució o cronificació de la inflamació. En aquesta tesi hem explorat la relació entre mecanismes inflamatoris i tumorigènics en models animals, que permeten estudiar la transició inflamació-tumorigènesi sense les influències degudes a la farmacoteràpia, i en mostres humanes. En models murins de colitis, càncer colorectal i càncer colorectal associat a colitis hem analitzat les relacions entre els canvis histopatològics i l’expressió de gens, i hem valorat quines modificacions de l’expressió de microRNA les acompanyen, buscant la seva possible repercussió en processos d’inflamació, proliferació, apoptosi i distorsió de l’arquitectura tissular. També hem estudiat com es modifiquen els perfils fenotípics de cèl·lules mononuclears de cara a establir-ne el valor com a biomarcadors putatius de la transició colitis-càncer. En material biològic humà, els nostres esforços s’han adreçat a valorar l’expressió gènica en biòpsies de còlon obtingudes d’individus sans, de pacients amb UC i d’adenomes, de cara a seleccionar els gens que presenten canvis d’expressió associats a processos tumorals i inflamatoris. També hem valorat in vitro fins quin punt la funció barrera intestinal és afectada per les secrecions dels monòcits, per a establir la possible relació causal entre un comportament anòmal dels monòcits i la permeabilitat intestinal incrementada que es dóna en la UC.

Els resultats obtinguts en els models murins ens han permès validar la correlació entre la inflamació intestinal i la promoció dels processos tumorigènics i constatar que la simple cronificació de la inflamació desorganitza la resposta reparadora provocant una marcada hiperplàsia i l’aparició de focus de criptes aberrants, fins i tot sense induir mutagènesi per administració d’agents alquilants. En els animals que reben un agent mutagen i pateixen episodis recurrents de colitis, els tumors són més nombrosos, més grans i presenten major grau de displàsia en relació als que s’observen sense el concurs d’episodis d’inflamació. Els tumors que apareixen en un context inflamatori presenten alteracions significatives en l’expressió dels gens tlr4, tlr9, cnnd1, cox2 i bcl2. Això suggereix una implicació dels gens esmentats en el desenvolupament de tumors associats a colitis. En aquests tumors s’evidencia també una disminució significativa de l'expressió de miR-135a, miR-21, miR-145, i miR-34a, fet que suposaria un increment d'expressió de les seves dianes. L’anàlisi predictiva amb eines bioinformàtiques ha permès seleccionar dianes d’interès en funció de la seva relació amb els processos de proliferació, inflamació, apoptosi, angiogènesi i organització tissular. Entre elles destaquem tiam1, vcl, stat3, ptk2, wnt1, pak4, p120, birc5, btg2, klf4, rtkn, i peli1.

L’anàlisi de l’expressió gènica sobre micromatrius partint de còlon humà sà, de pacients d’UC i d’adenomes, ha permès verificar quins gens es troben significativament alterats. De l'anàlisi GO, la comparació entre els diferents grups, i la literatura, hem seleccionat un llistat de gens biomarcadors putatius del CRC i associats també a UC: brca1, brca2, nbn, tp53, smad3, fcer1g, a2m, dock2, atf4, cxcl12, itga8, eps8, rhou, nrp1 i ptk2b. Pel que fa als monòcits de sang perifèrica, l’estimulació amb lligands de TLR4 determina una resposta secretora diferent en els monòcits de pacients d’UC en comparació amb els d’individus sans. Aquest perfil secretor diferencial pot ser parcialment responsable d’un deteriorament més acusat la funció barrera intestinal en pacients d’UC, afavorint la cronificació de la inflamació i l’aparició de displàsies.

Ulcerative colitis (UC) is associated to an increased risk to develop colorectal cancer (CRC). In the gut, inflammation and activation of receptors of innate immunity such as TLRs, accomplish several functions, including tailoring adaptive immune responses, deploying repair mechanisms and maintaining the intestinal barrier function. The tuning of such functions may result in resolution or chronification of the inflammation. Here we have explored the relationship between inflammatory and tumourigenic mechanisms in animal models - which allow the study of the inflammation-tumourigenesis transition without the biases due to pharmacotherapy -, and in human samples. We have analyzed the relationship between histopathological findings and gene expression variations in murine models of colitis, colorectal cancer and colitis associated colorectal cancer. The expression of microRNAs in these conditions has also been quantified and their potential repercussions in the expression of genes related to inflammation, proliferation, apoptosis and tissue organization has been explored. Changes in mononuclear cell phenotypic profiles have also been studied in order to assess their putative value as biomarkers of inflammation-tumourigenesis transition. In human samples, we intended to study gene expression in colon biopsies obtained from healthy individuals, UC patients and adenomas, in an attempt to find expression changes associated both to UC and CRC. Furthermore, we have evaluated in vitro to what extent the intestinal barrier function is affected by monocyte secretions, to establish whether an anomalous monocyte responsiveness may contribute to the enhanced intestinal permeability usually found in UC patients. The results obtained in the murine model show a strong correlation between intestinal inflammation and enhanced tumour development, probably resulting from a disregulation of repair mechanisms, as shown by the finding of a significant hyperplasia and increased occurrence of aberrant crypt foci. In animals receiving a mutagenic agent and undergoing recurrent colitic episodes, the tumours are larger, more abundant and exhibit a higher degree of dysplasia compared to tumours observed in mice receiving only the mutagenic agent. Tumours appearing in an inflammatory context display significant gene expression alterations in tlr4, tlr9, cnnd1, cox2, and bcl2. This suggests an involvement of these genes in colitis associated tumour development. Inflammation associated tumours also showed a significant decrease in miR-135a, miR-21, miR-145 and miR-34a expression, which may lead to an increased expression of their target mRNAs. Among them we have highlighted those involved in proliferation, inflammation, apoptosis, angiogenesis and tissue organization processes. We propose tiam1, vcl, stat3, ptk2, wnt1, pak4, p120, birc5, btg2, klf4, rtkn and peli1 as candidate genes for the follow up of the bias inflammation-tumourigenesis. Gene expression microarray analysis has allowed us to identify genes whose expression is significantly altered in biopsies taken from UC patients and colon adenomas compared to healthy tissue. On the basis of this comparison, literature and gene ontology analysis, we have selected a list of genes altered in CRC and also associated to UC, which may be useful as putative biomarker genes: bcra1, bcra2, ndn, tp53, smad3, fcer1g, a2m, dock2, atf4, cxcl12, itga8, eps8, rhou, nrp1 and ptk2b. Our results show too that TLR4 ligands elicit an enhanced secretory response in monocytes of UC patients compared to those of healthy individuals. This enhanced response induces increased disruptive effects on the intestinal barrier function in vitro, suggesting that an anomalous monocyte secretory profile may be partly responsible for the increased intestinal permeability found in UC patients, which may contribute to the chronification of colitis and promotion of dysplasia.