Transportador de aminoácidos heteromérico xCT: identificación, caracterización funcional y topología

Abstract

La familia de transportadores heteroméricos de aminoácidos posee la característica única de estar compuestos por dos subunidades: una subunidad pesada y una subunidad ligera unidas por un puente disulfuro. Mutaciones en alguno de sus miembros son responsables de aminoacidurias hereditarias, como la lisinuria con intolerancia a proteínas (LPI) o la cistinuria. <br/><br/>Al inicio de esta tesis, nos propusimos identificar alguna nueva subunidad ligera humana de esta familia. Mediante búsqueda por homología de secuencia se clonó el cDNA correspondiente a una nueva proteína altamente homóloga a una proteína de ratón asociada al sistema de transporte xc-. La caracterización funcional confirmó que xCT humano, en combinación con 4F2hc, induce una actividad de transporte de cistina y glutamato, con sodio-independencia (sistema xc-). Los perfiles de captación de los sustratos en función del pH del medio de transporte indican que tanto el L-glutamato como la L-cistina son transportados de forma aniónica, cada uno con una carga negativa neta. Por experimentos de salida de sustrato se determinó el carácter intercambiador de este transportador, con una estequiometría de 1:1.<br/>El patrón de expresión de xCT humano por Northern blot muestra una ligera banda presente únicamente en cerebro. Experimentos de RT-PCR también resultaron positivos para los islotes pancreáticos y líneas celulares correspondientes a líneas epiteliales y tumorales, mientras riñón e hígado no mostraron ninguna señal. El papel fisiológico de xCT parece estar implicado en la captación de cistina para la síntesis de glutatión y su mantenimiento, dándole un papel relevante en situaciones de estrés oxidativo. <br/>A continuación se abordó la determinación de la topología de xCT como modelo de subunidad ligera. Experimentos de inmunodetección evidencian la localización intracelular de los dos extremos de la proteína. Utilizando la estrategia de introducir cisteínas individuales en los distintos loops y testar su accesibilidad a reactivos tiol-específicos, la topología de xCT es compatible con un modelo de 12 dominios transmembrana. Los resultados obtenidos en la zona IL2-3, con dos residuos de accesibilidad exterior (el 110 y 112) flanqueados por residuos de accesibilidad interior (el 102, 109 y 116) en un rango de 15 aminoácidos nos hacen pensar en una estructura de reentrant loop, con el residuo H110 como ápice. El hecho que estas estructuras suelen ser zonas asociadas a la ruta de paso del sustrato del transportador, nos llevó a estudiar la implicación del residuo H110. <br/>En resumen, los resultados muestran que i) la biotinilación del residuo H110C se bloquea por los sustratos y el inhibidor no transportable 4SCPG; ii) la inactivación provocada por MTSES en el transporte de h110c también es protegida por los sustratos con una IC50 similar a la Km para cada sustrato; iii) esta protección es independiente de temperatura, y por tanto no implica grandes cambios conformacionales; y iv) aunque los mutantes H110C y H110D no alteraron la Km del transportador ni su especificidad de sustrato, la sustitución por una lisina inactiva totalmente la función de xCT. Por tanto, tenemos evidencias de que H110 se encuentra cercano al lugar de unión al sustrato o ruta de paso del mismo. <br/>Estos resultados pueden encontrarse en las publicaciones siguientes: <i>J Biol Chem</i> (2004) vol. 279, 31228-36, <i>J Biol Chem</i> (2004) vol. 279, 11214-21, y <i>Pflugers Arch</i>. (2001) vol. 442 (2) 286-296. <br/><br/>ENGLISH

The family of heteromeric amino acid transporters has the particular characteristic of being composed of two proteins: a light subunit (LSHAT) and a heavy subunit (HSHAT) linked by a disulfide bridge. Some of its members are associated with hereditary aminoacidurias. Characterisation of a new human LSHAT, responsible for transport system xc-, is reported here. Human xCT associates with 4F2 heavy chain and induces cystine/glutamate exchange with sodium independence and 1:1 molar ratio. <br/>Topology studies using immunodetection and substituted cysteine accessibility method reveal a model compatible with 12 transmembrane domains and intracellular N and C-terminus. The results obtained in the intracellular loop between 2 and 3 transmembrane domain (IL2-3), with two residues of extracellular accessibility (110 and 112) flanked by residues of intracellular accessibility (the 102, 109 and 116) in a rank of 15 amino acids, resembles the structure of a reentrant loop with apex in position H110. The fact that these structures are usually associated with the substrate pathway through the transporter, lead us to further studies with residue H110.<br/>In summary, the results on that position show that: i) biotinylation of H110C is blocked by its substrate and the non-transportable inhibitor 4-S-carboxiphenyl-glycine (4-S-CPG); (ii) the inactivation caused by MTSES in the transport of mutant H110C is also protected by each substrate with a IC50 similar to the Km; (iii) this protection is independent of temperature, and therefore it does not imply great conformational changes; and (iv) although mutants H110C and H110D did not alter the Km of the transporter nor their specificity of substrate, the substitution by a lysine inactivates the function of xCT totally. Therefore, we conclude that residue H110 resides near the binding site/translocation pathway of the substrates in the transporter xCT. <br/>These results can be found in the following publications: <I>J Biol Chem</I> (2004) vol. 279, 31228-36, <I>J Biol Chem</I> (2004) vol. 279, 11214-21, y <I>Pflugers Arch.</I> (2001) vol. 442 (2) 286-296.